Reactive Oxygen Species Assay Kit använder det cellpermeanta reagenset 2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) för att kvantitativt bedöma reaktiva syrearter i levande cellprover. Den lipofila icke-fluorescerande DCFDA:n passerar lätt cellmembranet genom passiv diffusion följt av deacetylering. Den deacylerade produkten är ett oxidantkänsligt 2',7'-diklorfluorescein (DCHF). DCHF oxideras senare av ROS för att bilda DCF. DCF är starkt fluorescerande och detekteras med fluorescensspektroskopi eller flödescytometri med excitation/emission vid 480 nm/525 nm. Rosup, en sammansatt blandning, är en ROS-inducerare och kan användas som en positiv kontroll.

Produktkomponenter

Frakt och förvaring

Detta kit levereras med en ispåse. Förvaras vid -20°C utan ljus i 1 år. Undvik upprepad frysning och upptining.

Appliceringsmetod

1. Reagensberedning
DCFH-DA-lösning: Centrifugera kort vid låg hastighet innan öppning. Förbered en fungerande DCFH-DA-lösning genom att späda 10 mM DCFH-DA i serumfritt medium för att få en slutlig koncentration på 10 μM.
[Notera]: DCFH-DA kan också spädas i media utan fenolrött. Använd nyberedd DCFH-DA-lösning, långtidsförvaring av utspädd DCFH-DA rekommenderas inte. Den exakta koncentrationen av DCFH-DA som krävs beror på vilken cellinje som används men ett generellt startintervall skulle vara 10-50 μM. För vissa celler, om fluorescensen för den negativa kontrollen (utan DCFH-DA-prob) är mycket stark, späd DCFH-DA till 2-5 μM och förkorta inkubationstiden på lämpligt sätt.
Rosup-lösning: Bered en 100 µM Rosup-arbetslösning genom att späda 100 mM Rosup-stamlösning i serumfritt medium. Generellt sett kan inkubation med Rosup vid 37 ℃ under 30 min-4 timmar i mörker öka ROS markant.
[Notera]: Inkubationstiden för Rosup beror på cellinjens känslighet. Till exempel 30 min för Hela och 1,5 h för MRC5. Om ökningen av ROS inte observeras inom 30 minuter, kan induktionstiden eller koncentrationen ökas på lämpligt sätt. Om ROS stiger för snabbt kan induktionstiden eller koncentrationen reduceras på lämpligt sätt.
Läkemedel: Förbered läkemedlet av intresse i komplett media med 10% FBS eller annan lämplig lösning till önskad koncentration.
2. Rekommenderat protokoll för vidhäftande celler
a) Cellförberedelse: Odla vidhäftande celler i standardcellodlingsmedia dagen före experimentet så att cellkonfluensen når 70 % vid tiden för experimentet.
b) Läkemedelsinduktion: Ta bort mediet. Överlag varje brunn med tidigare preparerade serumfria utspädda läkemedel och inkubera under önskad tid vid 37°C i mörker.
c) (Valfritt) Positiv kontroll: Lägg över den positiva kontrollbrunnen med tidigare beredd Rosup-lösning och inkubera under önskad tid vid 37°C i mörker.
[Notera]: För celler med kort stimuleringstid (vanligtvis inom 2 timmar), kan sonden också laddas först och sedan lägga till Rosup eller ett läkemedel av intresse.
d) ROS-sondladdning: Ta bort allt medium och tvätta cellerna med serumfritt medium 1-2 gånger. Lägg över varje brunn med tidigare beredd DCFH-DA-lösning. Inkubera vid 37 ℃ i 30 minuter i mörker.
e) Ta bort mediet och tvätta cellerna 1-2 gånger med serumfritt medium för att avlägsna fri DCFH-DA.
3. Rekommenderat protokoll för suspensionsceller
a) Cellberedning: Odla suspensionsceller till cirka 1,5 × 105 celler per brunn på dagen för experimentet.
b) Läkemedelsinduktion: Samla celler i ett koniskt rör genom centrifugering och återsuspendera dem i en lämplig mängd av tidigare preparerade serumfria utspädda läkemedel och inkubera under önskad tid vid 37°C i mörker.
c) (Valfritt) Positiv kontroll: Återsuspenderade de positiva kontrollcellerna med tidigare beredd Rosup-lösning och inkubera under önskad tid vid 37°C i mörker.
d) ROS-sondladdning: Samla upp i ett nytt rör och tvätta cellerna genom centrifugering två gånger i PBS. Återsuspenderade cellerna med tidigare beredd DCFH-DA-lösning med celldensitet på 1 × 106-2 × 107/ml. Inkubera sedan vid 37 ℃ i 30 minuter i mörker. Vänd på röret var 3-5 minut för att säkerställa full kontakt mellan sonden och cellerna.
[Notera]: Celldensiteten bör justeras enligt den efterföljande detektionsmetoden. Till exempel, för flödescytometri, bör antalet celler i ett enda rör inte vara mindre än 104/mL eller mer än 106/mL.
e) Samla och tvätta cellerna genom centrifugering två gånger med serumfritt medium för att avlägsna fri DCFH-DA.
4. Fluorescensdetektion och dataanalys
Fluorescensmikroskopi Mätning: Utför levande cellmikroskopi med en filteruppsättning lämplig för fluorescein (FITC) med ett fluorescensmikroskop. Gör en visuell poängsättning av celler för ljusstyrka och jämför mellan kontroll och prover eller använd bildanalysmetoder för att jämföra signaler mellan digitala fotografier av celler.
Flödescytometrimätning: De vidhäftande cellerna bör samlas upp med trypsin för att framställa en enstaka cellsuspension; För suspensionsceller samlas cellerna upp direkt. Helst bör 10 000 celler analyseras per experimentellt tillstånd. Celler bör inte vara alltför täta under experimentet (<1 × 106 celler/ml). Uteslut skräp och isolera cellpopulationen av intresse med gating. Med hjälp av genomsnittlig fluorescensintensitet, bestäm veckändringen mellan kontrollprov och behandlade prover med Ex/Em = 480/525 nm.
Mätning av fluorescerande mikroplattor: Mät plattan omedelbart på en fluorescensplattläsare vid Ex/Em = 480/525 nm i slutpunktsläge i närvaro av media. Subtrahera blankvärden från alla mätningar och bestäm veckändringen från analyskontrollen.

Varningar

1. Tvätta cellerna efter inkubation med DCFH-DA för att minska bakgrundsljudet.
2. Det rekommenderas att mäta fluorescensen så snart som möjligt efter inkubation för att undvika eventuella fel.
3. För din säkerhet och hälsa, vänligen bär laboratorierockar och engångshandskar för operationen.
4. Endast för forskningsanvändning!