Puromycin är ett aminoglykosidantibiotikum som produceras genom fermentering och metabolism av Streptomyces alboniger, som dödar grampositiva bakterier, olika djur- och insektsceller genom att hämma proteinsyntesen. Puromycin är effektivt mot E. coli i vissa fall. Mekanismen är den puromycin är en analog till 3´-terminalen av aminoyl-TrNA-molekyler, som kan binda till A-stället i ribosomen och inkorporeras i den förlängda peptidkedjan. Efter att puromycin binder till A-stället kommer det inte att delta i några efterföljande reaktioner, vilket resulterar i för tidig avbrytning av proteinsyntesen och frisättning av omogna polypeptider som innehåller puromycin vid C-terminalen.

Pac-genen som finns i den puromycinproducerande stammen Streptomyces alboniger kodar för ett puromycin N-acetyltransferas (PAC) som ger resistens mot puromycin. Denna egenskap används nu vanligen för att screena stabilt transfekterade däggdjurscellinjer som bär pac-genplasmider.

Den allmänna tillämpningen av puromycin vid valet av stabila celltransfektioner är relaterad till egenskaperna hos lentivirala vektorer. De flesta av de kommersiella lentivirala vektorerna bär nu pac-genen. I vissa specifika fall kan puromycin också användas för att screena för transformation av E. coli-stammar som bär pac-genplasmiden.

Denna produkt är lämplig för cellodling, vanlig arbetskoncentration är 1-10 µg/ml.

Dessutom tillhandahåller företaget Yeasen även puromycin (kat# 60209ES) i lösningsform, som är i ett annat tillstånd men har samma funktion.

Drag

Renhet≥98 %

Ansökningar

Lämplig för cellodling

Screen-specifika stabilt transfekterade däggdjurscellstammar som bär plasmider som bär pac-genen

Skärm de transformerade E. coli-stammar som bär pac-genplasmiden

Specifikationer

Komponenter

Frakt och förvaring

De siduromycin dihydroklorid produkter bör förvaras vid -15 ℃ ~ -25℃ för 2 år.

Instruktioner

1. Föreslagen arbetskoncentration

Däggdjursceller: 1-10 μg/ml, optimal koncentration måste bestämmas genom dödskurva.

Escherichia coli: LB-agarmedium användes för att screena Escherichia coli stabilt transformerad med pac-genen vid en koncentration av 125 μg/ml.

Notera: Screening av stabila E. coli-stammar med puromycin kräver exakt pH-justering.

Rekommenderade koncentrationer av puromycin hydroklorid

2. Upplösningsmetod

Lös puromycin i destillerat vatten för att framställa en stamlösning på 50 mg/ml. Efter sterilisering genom filtrering genom en 0,22 μm filtermembran, alikvot och lagra vid -25 till -15℃. Alternativt kan den lösas i metanol för att framställa en lagringslösning på 10 mg/ml.

3. Bestämning av puromycin dödande kurva (med shRNA-transfektion eller lentivirustransduktion som exempel)

Den effektiva screeningkoncentrationen av puromycin är relaterat till celltyp, tillväxttillstånd, celldensitet, cellmetabolism och cellcykelposition. För att screena för stabilt uttryckande shRNA-cellinjer är det viktigt att bestämma den lägsta koncentrationen av puromycin som dödar otransfekterade/transducerade celler. Det rekommenderas att kunder som gör experiment för första gången måste upprätta en dödningskurva som passar deras eget experimentsystem.

1) Dag 1: 24-brunnars plattan pläteras med en densitet av 5-8×104 celler/brunn och ett tillräckligt antal brunnar stryks ut för efterföljande gradientexperiment. Celler inkuberades över natten vid 37℃.

2) Dag 2: A) Förbered screeningmedium: färskt medium som innehåller olika koncentrationer av puromycin (som 0-15 μg/ml, minst 5 gradienter); B) Byt ut det nyberedda screeningsmediet i cellerna efter inkubation över natten; Sedan inkuberas cellerna vid 37℃.

3) Dag 4: Byt ut med nytt selektionsmedium och observera cellviabiliteten.

4) Beroende på tillväxttillståndet för cellerna, byt till färskt selektionsmedium var 2-3 dag.

5) Celler övervakades dagligen för att observera graden av livskraftiga celler för att bestämma den lägsta koncentrationen av läkemedel som är effektiv för att döda icke-transfekterade eller alla icke-transducerade celler inom 4-6 dagar efter starten av antibiotikascreeningen.

4. Screening av stabilt transfekterade däggdjurscellinjer

Efter transfektion av plasmiden innehållande pac-genen förökades cellerna i ett medium innehållande puromycin för att selektera stabila transfektanter.

1) 48 timmar efter transfektion odlas cellerna (original eller utspädda) i färskt medium innehållande en lämplig koncentration av puromycin.

Obs: Antibiotika är mest effektiva när celler aktivt delar sig. Om cellerna är för täta kommer effektiviteten av antibiotika att minska avsevärt. Det är bäst att plåta celler till en densitet på högst 25%.

2) Ta bort och byt ut odlingsmediet som innehåller puromycin var 2-3 dag.

3) Cellbildade foci bedöms 7 dagar efter screening. Lesioner kan kräva ytterligare en vecka eller mer, beroende på värdcellinjen och transfektionsscreeningseffektiviteten.

Obs: Observera celltillväxtstatusen varje dag. Screening av puromycin kräver minst 48 timmar, och screeningsperioden för effektiv koncentration av puromycin är i allmänhet 3-10 dagar.

4) Överför och placera 5-10 resistenta kloner i en 35 mm petriskål och fortsätt att odla med selektionsmedium i 7 dagar. Denna anrikningskultur är att förbereda för framtida cytotoxicitetsexperiment.

Dokument:

Säkerhetsdatablad

60210_MSDS_HB220421_SV.pdf

Manualer

60210_Manual_HB250114_SV.pdf

Citat och referenser:

[1] Furge KA. et al., 2001. Undertryckande av Ras-medierad tumörframkallning och metastasering genom hämning av Met-receptortyrosinkinaset. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 krävs i metastaserande cancerceller för Caveolin-1-förstärkt Rac1-aktivering, migration och invasion. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Belöningsbaserad hypertonikontroll genom ett syntetiskt hjärn-dopamingränssnitt. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotisk BID är en ATM-effektor i DNA-skada-responscellen. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) inducerar en CCR5-beroende accelererad utsöndring av syndekan-1 (CD138) och syndekan-4 från HeLa-celler och former.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. Det ärftliga hemokromatosproteinet, HFE, hämmar järnupptaget via nedreglering av Zip14 i HepG2-celler[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. TSC1-TSC2-komplexet krävs för korrekt aktivering av mTOR2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KNedreglering av mikro-RNA-1 (miR-1) i lungcancer. Undertryckande av tumörframkallande egenskaper hos lungcancerceller och deras sensibilisering för doxorubicin-inducerad apoptos av miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Bakteriofag Mu-integrering i jäst- och däggdjursgenom [J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. En icke-kanonisk cGAS-STING-PERK-väg underlättar det translationella programmet som är avgörande för senescens och organfibros. Nat Cell Biol. 2022 maj;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 2 maj. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 i små extracellulära vesiklar härledda från HNSCC definierar tumörassocierad immunsuppression medierad av makrofager i mikromiljön. J Extracellvesiklar. 2022 maj;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identifiering av ubiquitin-specifikt proteas 32 som en onkogen i glioblastom och de underliggande mekanismerna. Sci Rep. 2022 apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. Uterus globulinassocierat protein 1 (UGRP1) binder podoplanin (PDPN) för att främja en ny inflammationsväg under Streptococcus pneumoniae-infektion. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. MORTALIN-Ca2+-axeln driver medfödd rituximabresistens vid diffust storcelligt B-cellslymfom. Cancer Lett. 1 juli 2022; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 18 april. PMID: 35447282.