G418 Sulfate, även känt som Geneticin Sulfate, är ett aminoglykosid-antibiotikum och strukturellt liknar Gentamycin B1. Det stör proteinsyntesen genom att binda 80-talets ribosom och blockera förlängningsstegen. G418-sulfat är giftigt för både prokaryota och eukaryota celler, inklusive bakterier, jäst, högre växt- och däggdjursceller, såväl som protozoer och maskar. Resistensgenen (huvudsakligen neo), lokaliserad i transposon Tn601 (903) eller Tn5, är härledd från bakterier, men kan uttryckas i eukaryota celler. Resistensgenen kan introduceras i celler genom genrekombinationstekniker för att erhålla resistens av G418, som skulle kunna användas för att screena och upprätthålla odlingen av prokaryota eller eukaryota celler som bär resistensgenen.

I däggdjursceller kodar neo för uttrycket av aminoglykosid 3'-fosfotransferas (APH (3') II) efter att ha integrerats i det eukaryota genomet. Detta enzym inaktiverar antibiotikumet genom att kovalent modifiera amino- eller hydroxylfunktionen hos G418 och hämma interaktionen mellan antibiotika och ribosom, vilket ger cellen G418-resistens. Vid screening av stabila cellinjeexperiment bör avdödskurvorna (dos-responskurvor) fastställas för att bestämma den lägsta effektiva koncentrationen för att döda icke-resistenta celler.

I växtceller kan resistens erhållas genom transfektion av nptll-genresistent plasmid. nptII-genen kodar också för aminoglykosidfosfotransferas, ett enzym som inaktiverar flera antibiotika, inklusive G418, kanamycin och palomycin.

Drag

Renhet≥98 %

Standardiserad produktion, med fabrikens massproduktionsläge

Brett utbud av applikationer, som kan användas inom områdena molekylärbiologi och biokemisk experimentell forskning av vävnadskultur

Samarbetsplattformen täcker helheten

För att säkerställa produktkvalitetsstabilitet kontrolleras skillnaden mellan satser inom 1 %

Ansökningar

Screening av stabilt transfekterade cellinjer

Specifikationer

Komponenter

Frakt och förvaring

De G418 Sulfate (geneticin) produkter bör förvaras vid -15 ℃ ~ -25℃ för 3 år.

Instruktioner

1. Beredning av G418 förvaringslösning (50 mg/ml, aktiv koncentration)

1) Konvertering av verksamhetsenheter

Omvandling utfördes enligt denna formel: (1000/A0) xA1=A2

A0: Potensvärde för G418, som varierar från batch till batch. Se batchkvalitetsrapporten eller etiketten på flaskan.

A1: Koncentrationen av aktiv G418 du önskar.

A2: Den faktiska koncentrationen av G418.

Till exempel, om G418-aktivitetsvärdet för satsen är 750 U/mg och den aktiva koncentrationen av G418 är 50 mg/ml, är den faktiska pulverkoncentrationen som ska framställas 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/ml. Om 10 ml G418 förvaringslösning (aktiv koncentration, 50 mg/ml) bereds, ska 666,7 mg pulver vägas.

2) Sterilisering och konservering

Väg det faktiska pulvret som erhållits genom ovanstående omvandling och tillsätt 10 mL sterilt avjoniserat vatten för att lösa det helt.

Förväta 0,22 μm nålfilter med 5 mL sterilt avjoniserat vatten och sterilisera sedan G418-lösningen genom filtrering.Alikvotera den steriliserade G418-lösningen och förvara vid -20 ℃.

Obs: ① Filtrera inte den grumliga lösningen, eftersom lösningen inte har löst sig helt, filtreringsprocessen kommer att orsaka läkemedelsförlust, minska aktiviteten hos den slutliga lösningen. ② Det rekommenderas inte att använda odlingsmedier, fosfatlösningar eller organiska lösningsmedel för att förbereda lagringslösningen.

2. Vanligt använda screeningkoncentration

I allmänhet krävs en hög koncentration av G418 initialt för screening av transformatorer och använd en låg koncentration för att upprätthålla odling. Tillväxtförhållanden, celltyper och andra miljöfaktorer kan påverka den effektiva dosen av G418, så det rekommenderas att bestämma den optimala screeningskoncentrationen genom dödningskurvan (dos-responskurvan).

I allmänhet är screeningintervallet för däggdjursceller 200-2000 μg/mL, växtcell: 10-100 μg/mL, Jästcell: 500-1000 μg/mL.

Celllinjeexperimentella data

3. Etablering av dödande kurva

Obs: För att screena efter cellinjer med stabilt uttryck av målproteiner är det nödvändigt att bestämma den lägsta koncentrationen av antibiotika som kan döda otransfekterade värdceller. Detta kan uppnås genom att upprätta en dödande kurva (dos-respons-kurva). Minst sex koncentrationer bör väljas. G418 är mest aktiv vid behandling av mitotiska celler, så celler måste odlas under en tid innan G418 tillsätts.

1) Dag 1: Otransformerade celler placeras på en lämplig odlingsplatta med en celldensitet på 20-25 % vid 37 ℃ och odlas över natten i CO₂;

Obs: För celler som kräver högre densitet för att upptäcka livsduglighet kan mängden inokulering ökas.

2) Ställ in G418-koncentrationsgradienten inom lämpligt område enligt celltypen. Däggdjursceller kan ställas in på 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Dag 2: Ta bort det gamla mediet och ersätt det med ett nyberedd medium som innehåller motsvarande koncentration av läkemedel. Gör tre parallella för varje koncentration.

4) Byt sedan ut mot färskt medium som innehåller G418 var 3-4 dag.

5) Antal levande celler utförs vid en fast cykel (t.ex. varannan dag) för att bestämma lämplig koncentration. Välj den lägsta koncentrationen, som dödar majoriteten av cellerna inom ett idealiskt antal dagar (vanligtvis 7-10 dagar), som arbetskoncentration för stabil screening av transfektionsceller.

4. Screening av stabila transfekterade celler

1) 48 timmar efter transfektion användes G418-odlingsmedium innehållande lämplig koncentration för subkultur (direkt subkultur eller utspädd subkultur).

Obs: För att få bra screeningsresultat rekommenderas det att späda ut cellerna med högst 25 % överflöd.

2) Byt screeningmediet som innehåller läkemedel var 3-4 dag.

3) Mät cellkolonibildningen efter 7 dagars screening. Kolonibildning kan ta ytterligare en vecka eller mer, beroende på värdcellstyp, transfektion och screeningseffektivitet.

4) 5-10 resistenta kloner selekterades och överfördes till 35 mm cellodlingsplattor och odlades med läkemedelsinnehållande screeningmedium under 7 dagar.

5) Byt ut mot normalt medium.

Dokument:

Säkerhetsdatablad

60220_MSDS_HB220421_SV.pdf

Manualer

60220_Manual_HB250115_SV.pdf

Siffror

Figur 1.Stabilitetstest och validering av effektiv koncentration av genomycin mellan olika batcher

Experimentell stam: E. coli

G69 och G99 är två olika batcher

Användningskoncentrationen av genomycin bestämdes till 8 mg/L, 12 mg/L respektive 16 mg/L, och den effektiva minimikoncentrationen bestämdes till 16 mg/L, vilket perfekt hämmade tillväxten av diverse bakterier. Prestandan för de två satserna var konsekvent.