Hygromycin B, ett aminoglykosidantibiotikum syntetiserat av Streptomyces hygroscopicus, hämmar proteinsyntesen genom att störa 70S ribosomal translokation och inducera felläsning av mRNA-mall, vilket dödar prokaryoter (såsom bakterier), eukaryoter (såsom jästsvampar) och svampar från däggdjur.

Hygromycinresistensgener (hyg eller hph) härledda från Escherichia coli kodar för hygromycin B-fosfotransferas, som avgiftar hygromycin B till en icke-biologiskt aktiv fosforylerad produkt, vilket gör den till en utmärkt selektiv markör för screening och odling av prokaryota eller eukaryota celler som framgångsrikt transfekterats med hytromycinresistens. Dessutom, på grund av olika verkningssätt, används Hygromycin B ofta i kombination med G418 eller Blasticidin S för val av dubbelresistenta cellinjer. Hygromycin B kan också användas som ett antiviralt medel eftersom det selektivt tränger in i celler med ökad membranpermeabilitet på grund av virusinfektion och hämmar translation. Det kan också fungera som ett insektsavstötande medel genom att blandas med djurfoder.

Dessutom Yeasen företaget också Hygromycin B (kat# 60224ES) i lösningsform, som är i ett annat tillstånd men har samma funktion.

Drag

Standardiserad produktion, med fabrikens massproduktionsläge

Ansökningar

Screening av stabilt transfekterade cellinjer

Specifikationer

Komponenter

Frakt och förvaring

De Hygromycin B produkter ska förvaras kl -15℃ ~ -25℃ för 2 år.

Instruktioner

1. Beredning av stamlösningen (50 mg/ml)

Väg upp 0,5 g Hygromycin B och tillsätt det till 10 ml av 1×PBS, pH 7,4. Efter grundlig upplösning, filtrera genom en 0,22 μm filter för att sterilisera. Alikvotera i små volymer för engångsbruk (t.ex. 1 mL) och förvara vid -25 till -15℃eller 2 till 8℃.

2. Vanligt använda screeningkoncentration

Arbetskoncentrationen av hygromycin B som används för att screena stabila överföringsstammar måste variera beroende på celltyp, medium, tillväxtförhållanden och cellmetabolism, med rekommenderade koncentrationer på 50-1000 μg/ml. För det första experimentella systemet rekommenderas en dödskurva (dödskurva), dosreaktivitetskurvan, för att bestämma den optimala screeningskoncentrationen.

I allmänhet, däggdjursceller: 50-500 μg/ml; Bakterie-/växtceller: 20-200 μg/ml; Svampar: 300-1000 μg/ml.

3. Etablering av dödande kurva

Obs: För att screena stabila cellinjer är det nödvändigt att bestämma den lägsta koncentrationen av antibiotika som kan döda otransfekterade värdceller. Detta kan uppnås genom att upprätta en dödande kurva (dos-respons-kurva). Minst fem koncentrationer bör ordnas.

1) Dag 1: Otransformerade celler plankas i en lämplig odlingsplatta med en celldensitet av 20-25% och odlas över natten.

Obs: Mängden inokuleringsceller kan ökas för celler som kräver högre densitet för att upptäcka vitalitet.

2) Ställ in koncentrationsgradienten inom lämpligt område enligt celltypen.Däggdjursceller kan ställa in 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/ml. Späd hygromycin B-lösningen 1:10 med avjoniserat vatten eller PBS-buffert till 5 mg/ml. Späd sedan lösningen till motsvarande arbetskoncentration enligt följande tabell.

3) Dag 2: Ersätt med ett nyberedd medium som innehåller motsvarande koncentration av läkemedlet. Gör tre parallella prover för varje koncentration.

4) Byt sedan ut mot färskt medium som innehåller läkemedel var 3-4 dag.

5) Gör levande cellräkningar med fasta intervall (som varannan dag) för att bestämma lämplig koncentration som hämmar tillväxten av otransfekterade celler. Välj den lägsta koncentrationen som kan döda de allra flesta celler inom det ideala antalet dagar (vanligtvis 7-10 dagar) som arbetskoncentration för stabilt urval av transfektanter.

4. Screening av stabilt transfekterade däggdjurscellinjer

1) 48 timmar efter transfektion subodlades cellerna genom screeningmedium innehållande hygromycin B i lämplig koncentration (direkt eller utspädd).

Obs: Antibiotika fungerar bäst på aktivt delande celler. Om cellerna är för täta kommer inte antibiotikan att döda cellerna. Dela cellerna så att cellerna inte är mer än 25% konfluenta.

2) Byt screeningmedium var 3-4 dag.

3) Mät cellkolonibildningen efter 7 dagars screening. Kolonibildning kan ta ytterligare en vecka eller mer, beroende på värdcellstyp, transfektion och screeningseffektivitet.

4) Välj 5-10 resistenta kloner och överför till 35 mm cellodlingsplattor och odlas med läkemedelsinnehållande screeningmedium i 7 dagar.

5) Ersätt med färskt medium utan läkemedel för odling.

Dokument:

Säkerhetsdatablad

60225_MSDS_HB220420_SV.pdf

Manualer

60225_Manual_HB250115_SV.pdf