Aureobasidin A, även känd som AbA, Basifungin, breomycin A, är ett cykliskt esterpeptidantibiotikum isolerat från trådsvampen Aureobasidium Pullulans nr. R106. Det har en stark anti-svamp förmåga och är en hämmare av det inositolfosforylerade ceramidsyntaset AUR1. Det är giftigt för jäst även vid lägre koncentrationer (0,1-0,5 μg/mL). Arter av svampar som är mottagliga för Aureobasidin A inkluderar Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans och A. niger. Svamparter som är mottagliga för det inkluderar dentaljäst (Saccharomyces cerevisiae), SchizaccharomySchizaccharomyces, glabrata (Candida glabrata), Aspergillus bo (Aspergillus nidulans) och Aspergillus niger (A. niger.). Verkningsmekanismen är att Aureobasidin A hämmar aktiviteten av inositolfosforamidit (inositolfosforylceramid, IPC) syntas, som svamptillväxten är beroende av, och stör sfingolipidsyntesen, vilket dödar stammen ytterligare. Fler gener som kodar för IPC-syntaser har studerats som AUR 1-genen från Saccharomyces cerevisiae och AURA-genen från A. sinensis, som har homologi. Att dämpa dessa kodande gener gör stammarna resistenta mot Aureobasidin A, såsom AUR 1-C-genen.

Aureobasidin A är mycket lämplig som läkemedelsselektionsmarkör för screening av positiva kloner. Aureobasidin A-resistens är också en idealisk reporter i jäststudier med enkelhybrid och tvåhybrid. Denna produkt är en lösning av Aureobasidin A löst i metanol med en koncentration av 1 mg/ml.

Drag

Renhet≥97 %

Standardiserad produktion, med fabrikens massproduktionsläge

Ansökningar

Jäst två-hybrid studier

Jäst en-hybrid studier

Rigorös markör för val av jästläkemedel

Aureobasidin A-resistens är en idealisk reporter för jästhybridiseringsstudier

Specifikationer

Komponenter

Frakt och förvaring

De Aureobasidin A(AbA） produkter ska förvaras kl -15℃ ~ -25℃ för 2 år.

Instruktioner

1. Arbetskoncentration

Se relevant litteratur för specifik koncentration och utforska och optimera enligt dina egna experimentella förhållanden (såsom experimentellt syfte, celltyp, odlingsegenskaper, etc.)

2. Cellexperiment (in vitro experiment)

Aureobasidin A stoppar tillväxten av jästceller genom både ceramidförgiftning och berövande av essentiella inositolfosforylceramider^[1].

Trippel tandemupprepningar av varje CArG-box-motiv syntetiserades. Alla DNA-fragment klonades in i YlH-vektorn pAbAi (Clontech, Mountain View, USA) med användning av lämpliga restriktionsställen. Därefter linjäriserades varje sammansatt pAbAi-konstruktion med BstbI och transformerades till Saccharomyces cerevisiae Y1HGold-stam enligt Yeast Transformation System 2 Manual (Clontech, Mountain View, USA). Kloner som bär det önskade DNA-fragmentet screenades för autoaktivering på syntetiskt uracil-bortfallsmedium kompletterat med Aureobasidin A i koncentrationen 100–900 ng/ml, enligt anvisningarna (Clontech, Mountain View, USA)^[2].

De öppna läsramarna (ORF) för SlBES1-gener amplifierades och ligerades in i pGBKT7-GAL4BD-plasmiden. Fusions-GAL4BD-SlBES1-konstruktionerna transformerades ytterligare till Y2H Gold-jästceller. SD/−Trp-mediumplattor användes för att odla jästtransformanterna.De α-galaktosidasaktivitet hos transformanterna identifierades av X-α-gal och uttrycket av AUR1-C screenades av Aureobasidin A^[3].

3. Minsta hämmande koncentrationer av Aureobasidin för olika jästsvampar

4. Driftsprocedurer (för jästtransformationssystem som är resistenta mot AbA)

1) Tillsätt 0,5 mL jästkultur över natten till 50 mL YPD-medium (sammansättning: 1 L flytande medium innehåller 10 g jästextrakt, 20 g polypepton, 20 g D-glukos; för fast medium, tillsätt ytterligare 2% agar).

2) Inkubera vid 30℃ i cirka 6 timmar, tills OD660 är 1-2. När du använder diploider, mät OD660 till 2-4.

3) Centrifugera vid 1 000×g i 5 minuter.

4) Återsuspendera pelleten i 10 mL lösning A (sammansättning: 100 mM litiumacetat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA), centrifugera sedan vid 1 000×g i 5 minuter.

5) Esuspendera pelleten i lösning A tills OD660 är 150.

6) Alikvotera 100 µL av cellsuspensionen i ett rör och inkubera vid 30°C℃ i 1 timme.

7) Tillsätt 5 µg av vektorn (cirkulärt eller linjärt DNA) och 150 µg bärar-DNA (som har värmts till 100℃ i 10 minuter och kyldes sedan snabbt).

Obs: pAUR101 kräver linjärt DNA för transformation. Att använda cirkulärt DNA kommer att minska transformationseffektiviteten eller kan till och med misslyckas. pAUR112 och pAUR123 kräver fullständigt plasmid-DNA för transformation.

8) Tillsätt 850 µL lösning B (sammansättning: lös 40 g polyetylenglykol 4000 i 100 ml lösning A och blanda väl, förbered färskt före användning) och blanda försiktigt.

9) Inkubera vid 30℃ i 30 minuter, sedan vid 42℃ i 15 minuter.

10) Placera i rumstemperatur i 10 minuter.

11) Centrifugera vid 5 000 rpm i 1 minut och återsuspendera pelleten i 5 mL YPD-medium.

12) Inkubera vid 30℃ i 6 timmar till över natten.

13) Centrifugera vid 5 000-10 000 rpm och återsuspendera pelleten i 1-10 ml 0,9 % NaCl.

14) Platta 100 µL av cellsuspensionen på YPD-selektiva mediumplattor (innehållande en viss koncentration av AbA, beroende på stamtyp).Inkubera vid 30℃ i 3-4 dagar tills omvandlingen är klar.

15) Välj positiva transformanter och/eller bestäm transformationseffektiviteten (uttryckt som antalet kolonier som transformerats per mikrogram plasmid-DNA).

Dokument:

Säkerhetsdatablad

60231_MSDS_HB220420_SV.pdf

Manualer

60231_Manual_HB250116_SV.pdf

Siffror

Figur 1. Tillväxtdiagram för jästplatta

Experimentell stam:GS115

Användningsmängd: 0,05 μg/ml、0,1 μg/ml、0,5 μg/ml、1 μg/ml

Behandling: 3-5 Dags vid 30℃

Den övre raden är jäsprodukten och den nedre raden är märket T *.