1 หลักการออกฤทธิ์ของเจเนติโคไมซิน

Genetomycin (Geneticin, G418) เป็นยาปฏิชีวนะกลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ที่ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนโดยการบล็อกการขยายสายเปปไทด์โดยการจับกับไรโบโซม 70S และ 80S ในเซลล์โพรคาริโอตและยูคาริโอต กลไกนี้เป็นพิษต่อแบคทีเรีย ยีสต์ พืช และเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เมื่อเซลล์ได้รับการถ่ายยีนและผสานเข้ากับยีนต้านทานนีโอไมซินสำเร็จ (เช่น ยีนนีโอ) ยีนที่เข้ารหัสอะมิโนไกลโคไซด์ฟอสโฟทรานสเฟอเรส (APH (3) II) จะปรับเปลี่ยน G418 อย่างโคเวเลนต์เพื่อทำให้ไม่ทำงาน จึงทำให้เซลล์ที่เติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกที่มี G418 ต้านทานได้

ในการทดสอบทางพันธุกรรมระดับโมเลกุล G418 เป็นหนึ่งในสารที่ใช้กันทั่วไปในการถ่ายโอนยีนที่มีเสถียรภาพ

2 การประยุกต์ใช้ geneomycin

2.1 การคัดกรองสายเซลล์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนที่เสถียร

• G418 ถูกใช้เพื่อคัดกรองเซลล์ที่มียีนต้านทาน (เช่น ยีนนีโอ) โดยการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน อะมิโนไกลโคไซด์ฟอสโฟทรานสเฟอเรสที่เข้ารหัสโดยยีนต้านทานจะทำให้ G418 ไม่ทำงาน ซึ่งทำให้ G418 มีความต้านทานต่อเซลล์ โดยทั่วไป ช่วงการคัดกรองเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมคือ 200 – 2000 μg/mL โดยความเข้มข้นที่ใช้กันทั่วไปที่สุดคือ 100 – 700 μ g / mL โดยที่เซลล์พืชมีความเข้มข้น 10-100 μg/mL และเซลล์ยีสต์มีความเข้มข้น 500-1000 μ g / mL ต่อไปนี้เป็นความเข้มข้นที่ใช้สำหรับเซลล์บางประเภทโดยใช้ G418 เป็นข้อมูลอ้างอิง

เซลล์	แอปพลิเคชัน	ความเข้มข้นของการกระตุ้นของเจเนโอไมซิน (μg/mL)	ผลงานที่อ้างถึง
สายพันธุ์มิวคอร์	ก) เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ ข) เพาะเลี้ยงบนแบคทีเรียชนิดแห้ง	ก) 10 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ข) 30 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร	เฮิร์ธ และคณะ วารสารวิชาการแห่งชาติ ฉบับที่ 79, 7356-7360 (1982)
สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม	ก) เพื่อการคัดกรอง ข) เพื่อรักษาการเจริญเติบโต	ก) 400 -1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ข) 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร	คานาอานีและเบิร์ก วารสารวิชาการแห่งชาติ ฉบับที่ 79, 5166-5170 (1982)
ปลูก	ก) เพื่อการคัดกรอง ข) เพื่อรักษาการเจริญเติบโต	ก) 25-50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ข) 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร	อูร์ซิก และคณะ ชีวเคมี ไบโอฟิสิส เรส คอมมิวนิเคชั่น ข้อ 101:3, 1031-1037 (1981)
ยีสต์	ก) เพื่อการคัดกรอง ข) เพื่อรักษาการเจริญเติบโต	ก) 500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ข) 125-200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร	ฮิเมเนซและเดวีส์ ธรรมชาติ, ฉบับที่ 287, 869-871 (1980)
แบคทีเรีย	เพื่อการคัดกรอง	16 ไมโครกรัม/มล.	เวตซ์ และคณะ สารต้านจุลชีพ สารเคมี ว. 6:5, 579-581 (2517)

2.2 การน็อกเอาต์ยีนและการถ่ายโอนยีน

• ในการน็อกเอาต์ยีน G418 สามารถใช้เพื่อคัดกรองเซลล์ที่น็อกเอาต์ยีนเป้าหมายได้สำเร็จ ในการถ่ายโอนยีน G418 อำนวยความสะดวกในการรวมยีนแปลกปลอมเข้าไปในจีโนมของเซลล์โฮสต์

2.3 การคัดเลือกความต้านทานในวัฒนธรรมเซลล์

• ในระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์ G418 จะถูกใช้เพื่อคัดกรองเซลล์ที่ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ ซึ่งมักจะมียีนต้านทานเฉพาะ

3 ขั้นตอนการทดลองที่เกี่ยวข้องกับ geneomycin

3.1 การเตรียมสารละลายสต็อก G418 (50 มก./มล. ความเข้มข้นที่ใช้งานได้)

1) การแปลงหน่วยกิจกรรม

แปลงโดยใช้สูตร: (1000/A0) × A1 = A2 โดยที่ A0 คือความแรงของ G418 ซึ่งแตกต่างกันไปในแต่ละชุด โปรดดูรายงานการควบคุมคุณภาพสำหรับชุดที่เกี่ยวข้องหรือฉลากบนขวด A1 คือความเข้มข้นของ G418 ที่ต้องการเตรียม A2 คือความเข้มข้นของผงต่อปริมาตรจริงที่ต้องชั่งน้ำหนัก

ตัวอย่างเช่น หาก G418 หนึ่งชุดมีศักยภาพ 750 U/mg และคุณต้องการเตรียมความเข้มข้นที่ใช้งานได้ 50 mg/mL ความเข้มข้นของผงจริงที่ต้องเตรียมคือ 1,000/750 × 50 mg/mL = 66.67 mg/mL

หากเตรียมสารละลายสต๊อก G418 ปริมาณ 10 มล. (ความเข้มข้นที่ใช้งานได้ 50 มก./มล.) จะต้องใช้ผง 666.7 มก.

• การฆ่าเชื้อและการเก็บรักษา

โดยอิงตามน้ำหนักผงจริงที่ได้จากการแปลงข้างต้น ให้เติมลงในน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 10 มิลลิลิตรเพื่อละลายอย่างสมบูรณ์

ขั้นแรก ให้จุ่มตัวกรองไซริงค์ขนาด 0.22 ไมโครเมตรลงในน้ำดีไอออนไนซ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 5 มิลลิลิตร โดยเอาส่วนน้ำออกให้หมด จากนั้นกรองด้วยตัวกรองนี้เพื่อฆ่าเชื้อและแบ่งส่วนเป็นปริมาตรเล็กๆ สำหรับใช้ครั้งเดียว (เช่น 1 มิลลิลิตร) แล้วเก็บที่อุณหภูมิ -20°C เพื่อให้คงตัวได้นาน 1 ปี

3.2 การกำหนด Kill Curve

1) วันที่หนึ่ง: ใส่เซลล์ที่ยังไม่ได้เปลี่ยนรูปลงในเพลตที่มีความหนาแน่นของเซลล์ 20-25% ในเพลตเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม และฟักค้างคืนที่อุณหภูมิ 37°C, CO₂-

2) ตั้งค่าความเข้มข้นให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสมโดยอิงตามชนิดของเซลล์ โดยเลือกความเข้มข้นอย่างน้อย 6 ค่า (G418 จะออกฤทธิ์กับเซลล์มากที่สุดในระยะการแบ่งตัว ดังนั้นควรเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นระยะเวลาหนึ่งก่อนที่จะเติม G418) ตัวอย่างเช่น สำหรับเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ให้ตั้งค่า 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL

3) วันที่สอง: นำอาหารเลี้ยงเชื้อเก่าออก แล้วแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมไว้ใหม่ ซึ่งมียาที่มีความเข้มข้นตามที่กำหนด โดยทำซ้ำ 3 ครั้งสำหรับความเข้มข้นแต่ละระดับ

4) เปลี่ยนด้วยตัวกลางที่ประกอบด้วยยาใหม่ทุก 3-4 วัน

5) ทำการนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตในช่วงเวลาที่กำหนด (เช่น ทุก 2 วัน) เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมที่จะป้องกันการเติบโตของเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน เลือกความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดที่สามารถฆ่าเซลล์ส่วนใหญ่ได้ภายในจำนวนวันที่เหมาะสม (ปกติคือ 7-10 วัน) เป็นความเข้มข้นในการทำงานสำหรับการคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่ผ่านการถ่ายยีนที่เสถียร

3.3 การคัดกรองเซลล์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนที่เสถียร

• G418 Geneticin (60220ES) ที่จัดหาโดย Yisheng Biotech มีประสิทธิภาพ ≥ 720 U/mg ความบริสุทธิ์ ~98% และความเสถียรของชุดการผลิต โดยมีราคาเกือบหนึ่งในสามของผลิตภัณฑ์ G418 ของบริษัทอื่น
• เปลี่ยนวัสดุคัดกรองที่ประกอบด้วยตัวยาทุก 3-4 วัน
• การก่อตัวของโคลนเซลล์ (โคโลนี) ได้รับการสังเกตและประเมินหลังจากการคัดเลือก 7 วัน โคโลนีอาจใช้เวลาหนึ่งสัปดาห์หรือมากกว่านั้นในการสร้าง ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์โฮสต์ การถ่ายโอนยีน และประสิทธิภาพในการคัดกรอง
• โคลนที่ต้านทานจำนวน 5-10 โคลนถูกคัดเลือกและถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงเซลล์ขนาด 35 มม. และบำรุงรักษาต่อไปด้วยอาหารคัดกรองที่ประกอบด้วยตัวยาเป็นเวลา 7 วัน
• หลังจากเปลี่ยนวัฒนธรรมกลางปกติแล้ว

4 คำแนะนำสินค้า

เจเนติซิน G418 (60220ES) จัดทำโดย Yeasen Biotech มีประสิทธิผล ≥ 720 U/mg ความบริสุทธิ์ ~98% และความเสถียรของชุดผลิตภัณฑ์ โดยมีราคาเกือบหนึ่งในสามของผลิตภัณฑ์ G418 ของบริษัทอื่น

ข้อมูลจำเพาะ	ส*	ต*	Yeasen	Yeasen ข้อได้เปรียบ
เนื้อหา (HPLC)	-	-	~98%	ความบริสุทธิ์สูง
ศักยภาพ (U/มก.)	≥720 ไมโครกรัม/มก.	707-721 ไมโครกรัม/มก.	≥720 ไมโครกรัม/มก.	ประสิทธิภาพสูง
ราคา($/5ก.)	~1000	~1000	~200	ความถูก

5 กรณีทดลอง

ใน E. coli G69 และ G99 เป็นสองชุดที่แตกต่างกัน ความเข้มข้นของจีโนไมซินคือ 8 มก./ล. 12 มก./ล. และ 16 มก./ล. ตามลำดับ และความเข้มข้นต่ำสุดที่มีประสิทธิภาพคือ 16 มก./ล. ซึ่งยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียต่างๆ ได้อย่างสมบูรณ์