1 กหลักการ
ไฮโกรไมซิน บี (Hygromycin B) เป็นยาปฏิชีวนะประเภทอะมิโนไกลโคไซด์ที่ผลิตโดยการเผาผลาญของ Streptomyces hygroscopicus ซึ่งยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนโดยการรบกวนการเคลื่อนย้ายและส่งเสริมการอ่านไรโบโซม 80S ผิดพลาด จึงฆ่าเซลล์โพรคาริโอตและยูคาริโอตได้
ในปัจจุบันมักใช้ในการคัดกรองและรักษาเซลล์โพรคาริโอตหรือยูคาริโอตที่มียีนต้านทานไฮโกรไมซิน
2. การสมัคร
2.1 คัดกรองและรักษาการเพาะเลี้ยงเซลล์โปรคาริโอตหรือยูคาริโอต (เซลล์พืชและเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) ที่ได้รับการถ่ายยีนด้วย Hph อย่างเสถียร-เวกเตอร์ไฮโกรไมซิน บี ยีนต้านทาน (hyg หรือ hph) ที่ได้มาจาก Escherichia coli เข้ารหัสไฮโกรไมซิน บี ฟอสโฟทรานสเฟอเรส ซึ่งเปลี่ยนไฮโกรไมซิน บี ให้เป็นผลิตภัณฑ์ฟอสโฟรีเลตที่ไม่ได้ใช้งานทางชีวภาพ จึงสามารถทำการกำจัดพิษได้ เมื่อพิจารณาจากหลักการนี้ ไฮโกรไมซิน บี จึงเป็นเครื่องหมายที่เลือกได้ที่มีประโยชน์มากในการคัดกรองและรักษาเซลล์โพรคาริโอตหรือยูคาริโอตที่เพาะเลี้ยงซึ่งได้รับการถ่ายโอนยีนต้านทานไฮโกรไมซินสำเร็จ
2.2 เนื่องจากความแตกต่างในกลไกการออกฤทธิ์ ไฮโกรไมซิน บี มักถูกใช้ร่วมกับเจเนติกริน G418 บลีโอไมซิน และบลาสติซิดิน เอส เพื่อคัดกรองสายเซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีนด้วยเวกเตอร์สองตัวที่แตกต่างกันอย่างเสถียรHygromycin B มีกลไกการออกฤทธิ์ที่แตกต่างจาก G418 (Cat#60220ES), Bleomycin (Cat#60257ES) และ Blasticidins (หมายเลขหมวดหมู่ 60218ES) จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้ร่วมกับยาปฏิชีวนะแบบคัดเลือกชนิดอื่นในการทดลองแบบคัดเลือกคู่
2.3 ยาต้านไวรัส2.4 เป็นยาถ่ายพยาธิ ใช้ผสมในอาหารสัตว์และเลี้ยงสัตว์
2.5 การคัดกรองเซลล์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนอย่างเสถียร
ความเข้มข้นในการทำงานของไฮโกรไมซิน บี ที่ใช้ในการคัดกรองทรานส์เฟกแทนต์ที่เสถียรจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ อาหารเลี้ยงเชื้อ สภาวะการเจริญเติบโต และอัตราการเผาผลาญของเซลล์ ความเข้มข้นที่แนะนำคือ 50-1000 μg/mL สำหรับการใช้งานระบบทดลองครั้งแรก ขอแนะนำให้กำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมในการคัดกรองโดยการสร้างกราฟการฆ่า หรือกราฟการตอบสนองของปริมาณ โดยทั่วไป 50-500 μg/mL สำหรับเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม 20-200 μg/mL สำหรับแบคทีเรีย/เซลล์พืช 200-1000 μg/mL สำหรับเชื้อรา
3 โปรโตคอล
3.1 การเตรียมสารละลายสำหรับเก็บรักษา (50 มก./มล.)
ชั่งไฮโกรไมซิน บี 0.5 กรัม แล้วเติม 1×PBS, pH 7.4 10 มล. เมื่อละลายหมดแล้ว ให้กรองด้วยตัวกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตรเพื่อฆ่าเชื้อ แบ่งสารละลายที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วเป็นสัดส่วน แล้วเก็บที่อุณหภูมิ -20℃
3.2 ความเข้มข้นในการคัดกรองที่ใช้กันทั่วไป
ความเข้มข้นในการทำงานของไฮโกรไมซินบีสำหรับการคัดกรองสายพันธุ์ที่เสถียรจะแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์ อาหารเลี้ยงเชื้อ สภาวะการเจริญเติบโต และอัตราการเผาผลาญของเซลล์ ขอแนะนำให้สร้างกราฟการฆ่าเชื้อ (กราฟปริมาณ-การตอบสนอง) เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการคัดกรองในครั้งแรก โดยทั่วไปเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: 50-500 μg/mL; เซลล์แบคทีเรีย/พืช: 20-200 μg/mL; เชื้อรา: 300-1000 μg/mL
3.3 การจัดทำเส้นโค้งการฆ่า
【หมายเหตุ】เพื่อคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่เสถียร จำเป็นต้องกำหนดความเข้มข้นขั้นต่ำของยาปฏิชีวนะที่สามารถฆ่าเซลล์โฮสต์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน ซึ่งสามารถทำได้โดยการสร้างเส้นโค้งการฆ่า (เส้นโค้งปริมาณ-การตอบสนอง) ควรจัดเรียงความเข้มข้นอย่างน้อยห้าระดับ
1) วันที่ 1: เซลล์ที่ยังไม่ได้เปลี่ยนแปลงจะถูกวางลงในจานเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมโดยมีความหนาแน่นของเซลล์ 20-25% และเพาะเลี้ยงข้ามคืน【หมายเหตุ】สามารถเพิ่มปริมาณเซลล์ที่ฉีดได้สำหรับเซลล์ที่ต้องการความหนาแน่นสูงเพื่อตรวจจับความมีชีวิตชีวา
2) ตั้งค่าความเข้มข้นให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสมตามประเภทของเซลล์ เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสามารถตั้งค่าได้ 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL เจือจางสารละลาย Hygromycin B 1:10 ด้วยน้ำดีไอออนไนซ์หรือบัฟเฟอร์ PBS เป็น 5 มก./มล. จากนั้นเจือจางสารละลายจนถึงความเข้มข้นในการทำงานที่สอดคล้องกันตามตารางต่อไปนี้
| ความเข้มข้นสุดท้าย (μg/mL) | ปริมาตรปานกลาง (มล.) | ปริมาตรการเติม 5 มก./มล. ไฮโกรไมซิน บี (มล.) |
| 50 | 9.9 | 0.1 |
| 100 | 9.8 | 0.2 |
| 250 | 9.5 | 0.5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1.5 |
| 1,000 | 8.0 | 2.0 |
3) วันที่ 2: เปลี่ยนด้วยตัวกลางที่เตรียมใหม่ซึ่งมีความเข้มข้นของยาที่สอดคล้องกัน ทำตัวอย่างขนานกันสามตัวอย่างสำหรับความเข้มข้นแต่ละระดับ
4) เปลี่ยนด้วยสื่อสดที่มีตัวยาใหม่ทุก 3-4 วัน
5) การนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตจะดำเนินการเป็นรอบคงที่ (เช่น ทุกๆ 2 วัน) เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมในการป้องกันการเติบโตของเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน เลือกความเข้มข้นขั้นต่ำที่สามารถฆ่าเซลล์ส่วนใหญ่ได้ภายในจำนวนวันที่เหมาะสม (โดยปกติคือ 7-10 วัน) เป็นความเข้มข้นที่ใช้ในการคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่เสถียร
3.4 การคัดกรองเซลล์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนที่มีเสถียรภาพ
1) 48 ชั่วโมงหลังการถ่ายยีน เซลล์จะถูกเพาะเลี้ยงต่อโดยใช้ตัวกลางคัดกรองที่มีไฮโกรไมซินบีในความเข้มข้นที่เหมาะสม (โดยตรงหรือเจือจาง) 【หมายเหตุ】ยาปฏิชีวนะได้ผลดีที่สุดกับเซลล์ที่กำลังแบ่งตัว หากเซลล์มีความหนาแน่นมากเกินไป ยาปฏิชีวนะจะไม่ฆ่าเซลล์ ให้แยกเซลล์ออกเพื่อให้เซลล์รวมกันไม่เกิน 25%
2) เปลี่ยนสื่อคัดกรองทุกๆ 3-4 วัน
3) วัดการสร้างกลุ่มเซลล์หลังจากทำการคัดกรองเป็นเวลา 7 วัน การสร้างกลุ่มเซลล์อาจใช้เวลาอีกหนึ่งสัปดาห์หรือมากกว่านั้น ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์โฮสต์ การถ่ายโอนยีน และประสิทธิภาพของการคัดกรอง
4) คัดโคลนที่ต้านทานจำนวน 5-10 โคลน แล้วถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงเซลล์ขนาด 35 มม. แล้วเพาะเลี้ยงในอาหารคัดกรองที่ประกอบด้วยตัวยาเป็นเวลา 7 วัน
5) ทดแทนด้วยอาหารสดที่ไม่มียาในการเพาะเลี้ยง
4 คุณสมบัติ
ไฮโกรไมซิน บี เป็นผงสีขาวถึงน้ำตาลอมเหลือง มีกลิ่นพิเศษ ละลายได้ง่ายในน้ำ เมทานอล เอธานอล ฯลฯ และสร้างเกลือได้ง่ายกับกรดอินทรีย์และอนินทรีย์หลายชนิด
5 การจัดเก็บผลิตภัณฑ์
สามารถเก็บสารละลายได้โดยตรงที่อุณหภูมิ 2~8℃ และสามารถเก็บไว้ได้นานกว่า 6 เดือน
6 ข้อควรระวัง
1) เซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีน hph จะต้านทานต่อไฮโกรไมซิน และเซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีนจะแสดงออกอย่างเสถียรหรือชั่วคราว
2) พบยีนที่ต้านทานไฮโกรไมซิน บี (hyg หรือ hph) ในสายพันธุ์อื่น รวมถึง Streptomyces hygroscopicus และ Klebsiella pneumoniae นอกเหนือจาก E. Coli
7. คำแนะนำสินค้า
| ชื่อสินค้า | แมว# | ข้อมูลจำเพาะ |
| ไฮโกรไมซิน บี (50 มก./มล.) | 60224ES03 | 1 กรัม (20 มล.) |
| 60224ES10 | 10×1 กรัม (20 มล.) | |
| ไฮโกรไมซิน บี | 60225ES03 | 1 กรัม |
| 60225ES10 | 10กรัม |
8 บทความที่ตีพิมพ์โดยใช้สารเคมีของเรา
[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C และคณะ PTPS อำนวยความสะดวกในการแบ่งส่วนของ LTBP1 S-Nitrosylation และส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอกภายใต้ภาวะขาดออกซิเจน เซลล์โมล - 2020;77(1):95-107.e5. ดอย:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (รหัส:14.548)
[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX และคณะ โปรไฟล์สถานะโครมาตินแบบไดนามิกเผยให้เห็นบทบาทในการควบคุมของออกซินและไซโตไคนีนในการสร้างยอดใหม่ เดฟเซลล์ - 2022;57(4):526-542.e7. ดอย:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (ไอเอฟ:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW การวิเคราะห์เซลล์เดี่ยวของจุดยอดการเจริญเติบโตของ Arabidopsis เดฟเซลล์ - 2021;56(7):1056-1074. e8. ดอย:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (ไอเอฟ:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. พลวัตการเข้าถึงโครมาตินและโครงสร้างเครือข่ายควบคุมการถอดรหัสตามลำดับชั้นสำหรับการสร้างตัวอ่อนแบบโซมาติกของพืช เดฟเซลล์ - 2020;54(6):742-757.e8. ดอย:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (ไอเอฟ:10.092)
[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY และคณะ การคัดกรอง CRISPR/Cas9 ทั่วทั้งจีโนมระบุ CARHSP1 ที่รับผิดชอบต่อการต้านทานรังสีใน glioblastoma การตายของเซลล์ . 2021;12(8):724. เผยแพร่เมื่อวันที่ 21 กรกฎาคม 2021 doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (ถ้า:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z และคณะ การคัดกรองการกระตุ้นการถอดรหัส CRISPR-Cas9 ในระดับจีโนมในยีนที่เกี่ยวข้องกับการดื้อต่อเมตฟอร์มินของมะเร็งต่อมลูกหมาก ฟรอนท์เซลล์ เดฟ ไบโอล . 2021;8:616332. เผยแพร่เมื่อวันที่ 26 มกราคม 2021 doi:10.3389/fcell.2020.616332 (ถ้า:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z และคณะ วิศวกรรมศาสตร์ของตัวขนส่ง Yarrowia lipolytica สำหรับการผลิตกรดซัคซินิกจากชีวภาพที่มีประสิทธิภาพสูงจากกลูโคส เชื้อเพลิงชีวภาพ . 2021;14(1):145. เผยแพร่เมื่อวันที่ 27 มิถุนายน 2021 doi:10.1186/s13068-021-01996-w (ถ้า:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. วิศวกรรมยีสต์น้ำมัน Yarrowia lipolytica สำหรับการผลิต α-farnesene เชื้อเพลิงชีวภาพ . 2019;12:296. เผยแพร่เมื่อวันที่ 23 ธันวาคม 2019 doi:10.1186/s13068-019-1636-z (ไอเอฟ:5.452)
[9] Zhou C , Zeng Z, Suo J และคณะ การจัดการปัจจัยการถอดรหัสเดี่ยว Ant1 ส่งเสริมการสะสมแอนโธไซยานินในเมล็ดข้าวบาร์เลย์ เจ อากริค ฟู้ด เคมี . 2021;69(18):5306-5317. ดอย:10.1021/acs.jafc.0c08147 (ไอเอฟ:5.279)
[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z และคณะการระบุและลักษณะเฉพาะของแหล่งกำเนิดการจำลองไมโตคอนเดรียสำหรับการแสดงออกที่เสถียรและแบบเอพิโซมใน Yarrowia lipolytica เอซีเอส ซินธ์ ไบโอล . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (ถ้า:5.110)
9 สินค้าที่เกี่ยวข้อง
| ชื่อสินค้า | แมว# | ข้อมูลจำเพาะ |
| ซิโปรฟลอกซาซิน ไฮโดรคลอไรด์ | 60201ES05/25/60 | 5/25/100กรัม |
| แอมพิซิลลิน โซเดียมซอลท์ | 60203ES10/60 | 10/100กรัม |
| ดอกซีไซคลินไฮเคลต | 60204ES03/08/25 | 1/5/25กรัม |
| คลอแรมเฟนิคอล เกรด USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100กรัม |
| คาเนมัยซินซัลเฟต | 60206ES10/60 | 10/100กรัม |
| เตตราไซคลิน HCl เตตราไซคลินไฮโดรคลอไรด์ (USP) | 60212ES25/60 | 25/100กรัม |
| แวนโคไมซินไฮโดรคลอไรด์ | 60213ES60/80/90 | 100มก./1ก./5ก. |
| เกลือเจนตามัยซินซัลเฟต | 60214ES03/08/25 | 1/5/25กรัม |
| สเปกติโนไมซิน ไฮโดรคลอไรด์ | 60215ES08 | 5กรัม |
| เฟลโอไมซิน (20 มก./มล. ในสารละลาย) | 60217ES20/60 | 20/5×20มก. |
| บลาสติซิดิน เอส (บลาสติซิดิน) | 60218ES10/60 | 10/10×10มก. |
| ไนสแตติน | 60219ES08 | 5กรัม |
| G418 ซัลเฟต (เจเนติซิน) | 60220ES03/08 | 1/5กรัม |
| พูโรไมซิน (สารละลาย 10 มก./มล.) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 มล. |
| พูโรไมซิน ไดไฮโดรคลอไรด์ | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 มก. / 1 ก. |
| ไฮโกรไมซิน บี (50 มก./มล.) | 60224ES03 | 1 กรัม (20 มล.)/10×1 กรัม (20 มล.) |
| ไฮโกรไมซิน บี | 60225ES03/10 | 1/10กรัม |
| อีริโทรไมซิน | 60228ES08/25 | 5/25กรัม |
| ทิเมนติน | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2กรัม |
| ออเรโอบาซิดิน เอ (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1มก. |
| โพลีมิกซินบีซัลเฟต | 60242ES03/10 | 1/10หมู่ |