โดยทั่วไปแล้ว อะพอพโทซิสหมายถึงการตายของเซลล์ที่ได้รับการตั้งโปรแกรมไว้ ซึ่งเกิดขึ้นจากการควบคุมยีนภายในเซลล์และผลิตภัณฑ์ของยีนในระหว่างการพัฒนาเซลล์หรือภายใต้การกระทำของปัจจัยบางอย่าง อะพอพโทซิสมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาและการสร้างรูปร่างของตัวอ่อน การรักษาเสถียรภาพของประชากรเซลล์ปกติในเนื้อเยื่อ การป้องกันและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกาย ความเสียหายของเซลล์และการแก่ก่อนวัยที่เกิดจากโรคหรือพิษ และการเกิดและการลุกลามของเนื้องอก และมีความสำคัญในการบำบัดรักษา

เหตุการณ์ในเส้นทางอะพอพโทซิสเกิดขึ้นในลำดับเวลา นั่นคือ เหตุการณ์ต่างๆ เกิดขึ้นตามลำดับ และในที่สุดนำไปสู่การเกิดขึ้นของอะพอพโทซิส พร้อมกับการเกิดอะพอพโทซิส

ลักษณะทั่วไปมีดังนี้:

1. ภาวะอะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น: การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเยื่อหุ้มเซลล์ การเบี่ยงเบนของฟอสฟาติดิลเซอรีน

2. อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้นและระยะกลาง: ความหนาแน่นของไซโตพลาซึมเพิ่มขึ้น ศักย์เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียหายไป ความสามารถในการซึมผ่านเปลี่ยนไป และไซโตโครมซีถูกปล่อยเข้าไปในไซโตพลาซึม

3. ภาวะอะพอพโทซิสล่าช้า: การถ่ายทอดสัญญาณอะพอพโทซิส

4. ภาวะอะพอพโทซิสล่าช้า: DNA สลายตัวเหลือขนาดชิ้นส่วน 180~200bp

รูปที่ 1: การเกิดและการตรวจจับเหตุการณ์ตามลำดับในเส้นทางอะพอพโทซิส

1. อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น: Annexin-V/PI การย้อมสองครั้ง (การตรวจจับ PS บนเยื่อหุ้มเซลล์ภายนอก)

ในเซลล์ที่มีชีวิตปกติ ฟอสฟาติดิลเซอรีน (PS) จะอยู่ที่ด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ เมื่อเกิดอะพอพโทซิส เยื่อหุ้มเซลล์จะเปลี่ยนไป และ PS จะพลิกจากพื้นผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังพื้นผิวด้านนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ Annexin-V เป็นโปรตีนจับฟอสโฟลิปิดที่ขึ้นกับ Ca2+ โดยมีน้ำหนักโมเลกุล 35-36 KD ซึ่งสามารถจับกับ PS ได้ด้วยความสัมพันธ์สูง การใช้ Annexin-V ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสซีน (FITC, Alexa fluor488 เป็นต้น) เป็นโพรบ ทำให้สามารถระบุเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสและเซลล์ที่มีชีวิตได้ด้วยการไหลเวียนของไซโตเมทรีหรือกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์

PS ของเซลล์ที่ตายจะพลิกกลับจากพื้นผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังพื้นผิวด้านนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ Annexin-V ยังสามารถจดจำ PS บนพื้นผิวของเซลล์ที่ตายได้ ดังนั้น Annexin-V จึงไม่สามารถแยกแยะเซลล์ที่ตายจากเซลล์ที่กำลังจะตายได้ นอกจากนี้ โพรพิดีนไอโอไดด์ (PI) ยังเป็นสีย้อมกรดนิวคลีอิกที่สามารถจับกับ DNA ในเซลล์ได้ และไม่สามารถทะลุผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ทั้งหมดได้ เยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่กำลังจะตายในระยะเริ่มต้นและเซลล์ที่มีชีวิตยังคงไม่บุบสลาย และสีย้อม PI ไม่สามารถเข้าสู่เซลล์ได้อย่างอิสระผ่านเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อจับกับ DNA ดังนั้นสีย้อม PI จึงไม่สามารถติดฉลากเซลล์ที่กำลังจะตายและเซลล์ที่มีชีวิตได้ แต่สีย้อม PI สามารถจับกับ DNA ในเซลล์ได้ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ตาย สีย้อม PI ในเซลล์ที่ตายแล้วจะเปล่งแสงสีแดงหลังจากถูกกระตุ้นด้วยเลเซอร์ 488 นาโนเมตร และจะรับโดยช่องสัญญาณที่เกี่ยวข้อง ดังนั้นจึงสามารถใช้ Annexin V และ PI ร่วมกันเพื่อแยกแยะเซลล์ที่มีชีวิต เซลล์ที่เข้าสู่ภาวะอะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น และเซลล์ที่ตายได้

รูปที่ 2: การวิเคราะห์ผลการไหลเวียนของไซโตเมทรีหลังจากการย้อมคู่แบบแอนเน็กซิน-วี/ไพ

การสั่งซื้อสินค้า:

2. อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น: การย้อม JC-1 (การตรวจจับการเปลี่ยนแปลงศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย)

กระบวนการอะพอพโทซิสมักเกิดขึ้นพร้อมกับการทำลายศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ไมโตคอนเดรีย ซึ่งโดยทั่วไปถือว่าเป็นเหตุการณ์แรกๆ ในกระบวนการอะพอพโทซิสแบบคาสเคด เกิดขึ้นก่อนที่จะมีลักษณะของอะพอพโทซิสแบบนิวเคลียสปรากฏขึ้น (ความเข้มข้นของโครมาติน การแตกของดีเอ็นเอ) เมื่อศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ไมโตคอนเดรียพังทลาย อะพอพโทซิสของเซลล์ก็ไม่สามารถย้อนกลับได้ การมีอยู่ของศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ไมโตคอนเดรียทำให้สีย้อมเรืองแสงที่มีประจุบวกบางชนิด เช่น โรดามีน 123, JC-1, JC-10 จับกับเมทริกซ์ของไมโตคอนเดรียได้ การเพิ่มหรือลดของฟลูออเรสเซนต์บ่งชี้ถึงการเพิ่มขึ้นหรือลดลงของอิเล็กโตรเนกาติวิตี้ของเยื่อหุ้มเซลล์ไมโตคอนเดรีย

JC-1 ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อตรวจจับศักย์เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย △ΨM ซึ่งแสดงให้เห็นการสะสมที่ขึ้นอยู่กับศักย์ในไมโตคอนเดรีย ในไมโตคอนเดรียปกติ JC-1 จะรวมตัวกันในเมทริกซ์ไมโตคอนเดรียเพื่อสร้างโพลีเมอร์ซึ่งเปล่งแสงเรืองแสงสีแดงอย่างรุนแรง (ex = 585 นาโนเมตร, em = 590 นาโนเมตร) ในเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิส ศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ไมโตคอนเดรียจะดีโพลาไรซ์ JC-1 จะถูกปล่อยออกมาจากไมโตคอนเดรีย ความเข้มข้นลดลง และเปลี่ยนกลับเป็นรูปแบบโมโนเมอร์ที่เปล่งแสงเรืองแสงสีเขียว ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงของสีจึงสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงศักย์เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียโดยตรง ระดับของภาวะโพลาไรเซชันของไมโตคอนเดรียยังสามารถวัดได้จากอัตราส่วนความเข้มของฟลูออเรสเซนต์สีแดง/เขียว การตรวจจับ JC-1 เป็นวิธีการทั่วไป

3. อะพอพโทซิสระยะท้าย: วิธี TUNEL (วิธีการติดฉลากชิ้นส่วน DNA ในแหล่งกำเนิด)

ในระยะปลายของอะพอพโทซิส จะมีปลาย 3-OH ที่เหนียวจำนวนมากเกิดขึ้นเนื่องจากการแตกหักของสายคู่หรือการแตกหักของสายเดี่ยวของดีเอ็นเอของโครโมโซม ภายใต้การกระทำของดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์เทอร์มินอลทรานสเฟอเรส (TdT) ลูซิเฟอเรส dUTP ที่ถูกติดฉลากด้วยลูซิเฟอเรสสามารถจับกับปลาย 3 ของดีเอ็นเอได้ เพื่อให้สามารถตรวจพบเซลล์อะพอพโทซิสได้ วิธีการดังกล่าวเรียกว่าการติดฉลากปลายนิกที่ดำเนินการโดยดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์เทอร์มินอลทรานสเฟอเรส (TUNEL) เนื่องจากเซลล์ปกติหรือเซลล์ที่กำลังแพร่กระจายแทบจะไม่มีการแตกหักของดีเอ็นเอ จึงไม่มีการก่อตัวของ 3-OH และสามารถย้อมได้เพียงเล็กน้อย TUNEL เป็นวิธีการวิจัยที่ผสมผสานระหว่างชีววิทยาโมเลกุลและสัณฐานวิทยา การย้อมในสถานที่ของนิวเคลียสอะพอพโทซิสหรืออะพอพโทซิสบอดีตัวเดียวที่สมบูรณ์สามารถสะท้อนลักษณะทางชีวเคมีและสัณฐานวิทยาทั่วไปของอะพอพโทซิสได้อย่างแม่นยำ สามารถใช้ตรวจสอบสัณฐานวิทยาของเซลล์ของชิ้นเนื้อฝังพาราฟิน ชิ้นเนื้อแช่แข็ง เซลล์เพาะเลี้ยง และเซลล์ที่แยกจากเนื้อเยื่อ และสามารถตรวจจับเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสได้จำนวนเล็กน้อย ดังนั้นจึงใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาเกี่ยวกับอะพอพโทซิส

สินค้าที่เกี่ยวข้อง: