พูโรไมซิน เป็นยาปฏิชีวนะประเภทอะมิโนไกลโคไซด์ที่ผลิตโดยสเตรปโตไมซีส อัลโบนิเกอร์ เป็นอนาล็อกของปลาย 3' ของโมเลกุลอะมิโนแอซิล-ทรีอาร์เอ็นเอ และสามารถจับกับตำแหน่งเอของไรโบโซม รวมเข้ากับโซ่เปปไทด์ที่ขยายออก ขัดขวางการเคลื่อนย้ายเปปไทด์บนไรโบโซม ทำให้เกิดการยุติโซ่ก่อนกำหนดระหว่างการแปล และด้วยเหตุนี้จึงยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน
รูปที่ 1 สูตรโครงสร้างของ Puromycin (CAS NO. 53-79-2)
ยีน pac ซึ่งเข้ารหัส puromycin N-acetyltransferase (pac) พบในแบคทีเรียที่ผลิต puromycin Streptomyces alboniger ซึ่งทำให้เกิดความต้านทานต่อ puromycin ลักษณะนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบันเพื่อคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่เสถียรของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ถ่ายโอนพลาสมิดที่มียีน pac การใช้ puromycin อย่างแพร่หลายในการคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่เสถียรมีความเกี่ยวข้องกับลักษณะของเวกเตอร์เลนติไวรัส ซึ่งส่วนใหญ่มียีน pac ในเวกเตอร์เลนติไวรัสเชิงพาณิชย์ ในบางกรณีเฉพาะ puromycin ยังสามารถใช้เพื่อคัดกรองสายพันธุ์ E. coli ที่เปลี่ยนรูปด้วยพลาสมิดที่มียีน pac ได้อีกด้วย puromycin ออกฤทธิ์เร็วและสามารถทำให้เซลล์ตายได้อย่างรวดเร็วที่ความเข้มข้นต่ำ เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ยึดติดจะไวต่อความเข้มข้น 2-5 µg/mL ของ puromycin ในขณะที่เซลล์ที่แขวนลอยจะไวต่อความเข้มข้นของ puromycin ที่ต่ำถึง 0.5-2 µg/mL เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีความต้านทานต่อ puromycin อย่างเสถียรสามารถสร้างขึ้นได้ภายในหนึ่งสัปดาห์
การคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่มีเสถียรภาพ
หลักการทดลอง
โดยการโคลน DNA/shRNA จากภายนอกเข้าไปในเวกเตอร์ที่มียีน pac เวกเตอร์รีคอมบิแนนท์จะถูกถ่ายโอนเข้าไปในเซลล์โฮสต์และรวมเข้าไปในโครโมโซมของโฮสต์ จากนั้นถ่ายทอดอย่างเสถียรด้วยการแบ่งเซลล์ และในที่สุดก็คัดกรองด้วยพิวโรไมซิน
การเตรียมตัวและการทดลองก่อน
1 ความเข้มข้นที่แนะนำในการใช้งาน
เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: 1-10 μg/mL ความเข้มข้นที่เหมาะสมต้องได้รับการกำหนดก่อนการทดลอง
E.coli: สำหรับการคัดกรอง E. coli ที่เปลี่ยนสภาพแล้วและมีเสถียรภาพซึ่งมียีน pac บนอาหารเลี้ยงเชื้อ LB agar ให้ใช้ความเข้มข้น 125 μg/mL การปรับ pH อย่างแม่นยำเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการคัดกรอง puromycin ของ E. coli ที่เปลี่ยนสภาพแล้วอย่างมีเสถียรภาพ
2 วิธีการละลาย
ละลายพิวโรไมซินในน้ำกลั่นเพื่อเตรียมสารละลายสต็อก 50 มก./มล. กรองด้วยแผ่นกรอง 0.22 μm แบ่งส่วน และเก็บที่อุณหภูมิ -20°C
3. การกำหนด Puromycin Kill Curve (โดยใช้การถ่ายโอน shRNA หรือการถ่ายโอนเลนติไวรัสเป็นตัวอย่าง)
ความเข้มข้นของพูโรไมซินในการคัดกรองที่มีประสิทธิภาพนั้นสัมพันธ์กับชนิดของเซลล์ สถานะการเจริญเติบโต ความหนาแน่นของเซลล์ การเผาผลาญของเซลล์ และตำแหน่งของวงจรเซลล์ การกำหนดความเข้มข้นขั้นต่ำของพูโรไมซินที่จะฆ่าเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนนั้นถือเป็นสิ่งสำคัญ จำเป็นต้องทำการทดลองคัดกรองแบบไล่ระดับของพูโรไมซินก่อนการทดลองครั้งแรกเพื่อสร้างเส้นโค้งการฆ่า
- เซลล์เพลทที่มีความหนาแน่น 5~8×104เซลล์/หลุมในจาน 24 หลุมและเพาะเลี้ยงข้ามคืน
- เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการคัดกรอง: อาหารเลี้ยงเชื้อสดที่มีสารพิวโรไมซินในความเข้มข้นต่างกัน (เช่น 0-15 μg/mL อย่างน้อย 5 ระดับ)
- เปลี่ยนเป็นอาหารคัดกรองที่เตรียมสดใหม่ ดำเนินการเพาะเลี้ยงต่อไป และสังเกตการเจริญเติบโตของเซลล์ โดยเปลี่ยนอาหารคัดกรองสดทุกๆ 2-3 วัน
- สังเกตการอยู่รอดของเซลล์ทุกวัน ความเข้มข้นของยาที่สามารถฆ่าเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนทั้งหมดได้อย่างมีประสิทธิผลภายใน 4-6 วันคือความเข้มข้นต่ำสุด
การคัดกรองทรานส์เฟกแตนต์ที่มีความคงตัว
- หลังจากการติดเชื้อเลนติไวรัสเป็นเวลา 48-72 ชั่วโมง (ความเข้มข้น 70-80%) ให้เพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีพูโรไมซินในความเข้มข้นที่เหมาะสมเป็นเวลาอย่างน้อย 48 ชั่วโมง เมื่อเซลล์ทั้งหมดในกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนด้วยพูโรไมซินตาย เซลล์ที่เหลือในกลุ่มที่ติดเชื้อไวรัสจะเป็นเซลล์บวกทั้งหมด
【หมายเหตุ】: ① ผลของยาปฏิชีวนะจะเด่นชัดที่สุดเมื่อเซลล์อยู่ในช่วงการแบ่งตัวที่กระตือรือร้น ประสิทธิภาพของยาปฏิชีวนะจะลดลงอย่างมากหากเซลล์มีความหนาแน่นมากเกินไป ความหนาแน่นของเซลล์ไม่ควรเกิน 25% ② สังเกตสถานะการเติบโตของเซลล์ทุกวัน การคัดกรองพูโรไมซินต้องใช้เวลาอย่างน้อย 48 ชั่วโมง และความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของการคัดกรองพูโรไมซินมักจะกินเวลา 3 ถึง 10 วัน ยิ่ง MOI ของไวรัสสูงขึ้น เซลล์แต่ละเซลล์ก็จะมีสำเนาของ shRNA และยีนดื้อพูโรไมซินมากขึ้น เมื่อทำการคัดกรองพูโรไมซิน ยิ่ง MOI สูงขึ้น เซลล์ก็จะมีสำเนาของ PAC มากขึ้น และความเข้มข้นของพูโรไมซินที่เซลล์สามารถทนได้ก็จะสูงขึ้น ปรับความเข้มข้นของพูโรไมซินเพื่อคัดกรองเซลล์ที่ถ่ายโอนยีน แต่ความเข้มข้นของพูโรไมซินไม่ควรต่ำกว่าความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพขั้นต่ำของเส้นโค้งการฆ่า
- เติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี Puromycin ในความเข้มข้นต่ำสุดเพื่อขยายเซลล์ และเมื่อผลการทดสอบ qPCR ได้รับการรับรองแล้ว ให้ดำเนินการแช่แข็งเพื่อการเก็บรักษา
| ผลิตภัณฑ์ส ชื่อ | แมว# | ข้อมูลจำเพาะ | รูปร่าง |
| พูโรไมซิน ไดไฮโดรคลอไรด์ เลขทะเบียน CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 มก. | สีขาวจนเป็นผงสีขาว |
| 60210ES60 | 100 มก. | ||
| 60210ES72 | 250 มก. | ||
| 60210ES76 | 500 มก. | ||
| 60210ES80 | 1 จี | ||
| พูโรไมซิน (สารละลาย 10 มก./มล.) เลขทะเบียน CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 มล. | สารละลาย (10 มก./มล. ใน H2โอ） |
| 60209ES50 | 5×1 มล. | ||
| 60209ES60 | 10×1 มล. | ||
| 60209ES76 | 50×1 มล. |
คำแนะนำสินค้า
สิ่งพิมพ์โดยลูกค้าที่ใช้ผลิตภัณฑ์นี้ (สถิติบางส่วน: บางส่วน)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y และคณะ ทางเดิน cGAS -STING-PERK ที่ไม่ใช่แบบดั้งเดิมช่วยอำนวยความสะดวกให้กับโปรแกรมการแปลที่สำคัญต่อภาวะชราและพังผืดในอวัยวะ แนทเซลล์ไบโอล - 2022;24(5):766- 782. ดอย:10.1038/s41556-022-00894-z (ไอเอฟ:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J และคณะ CD73 ในเวสิเคิลนอกเซลล์ขนาดเล็กที่ได้จาก HNSCC กำหนดภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกซึ่งถูกควบคุมโดยแมคโครฟาจในสภาพแวดล้อมจุลภาค เจ เอ็กซ์ตร้าเซลล์เวสิเคิล - 2022;11(5):e12218. ดอย:10.1002/jev2.12218 (ถ้า:25.841)
(3) Meng F, Yu Z, Zhang D และอื่น ๆการแยกเฟสที่เหนี่ยวนำของ NF2 ที่กลายพันธุ์จะกักขังกลไก cGAS-STING เพื่อยกเลิกภูมิคุ้มกันต่อเนื้องอก เซลล์โมล - 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (ไอเอฟ:17.970)
[ 4] Chen S, Liu S, Wang J และคณะ การกำหนดเป้าหมาย DRP1 ที่ถูกควบคุมโดย TBK1 ช่วยให้สามารถรับรู้กรดนิวคลีอิกเพื่อทำการรีโปรแกรมพลวัตและสรีรวิทยาของไมโตคอนเดรีย เซลล์โมล - 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (รหัส:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C และคณะ PTPS อำนวยความสะดวกในการแบ่งส่วนของ LTBP1 S-Nitrosylation และส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอกภายใต้ภาวะขาดออกซิเจน เซลล์โมล - 2020;77(1 ):95-107.e5. ดอย:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (รหัส:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X และคณะ การยับยั้งของ FACT Complex กำหนดเป้าหมายไปที่การส่งสัญญาณของเม่นที่ผิดปกติและเอาชนะความต้านทานต่อสารต่อต้านที่ทำให้เรียบเนียน มะเร็ง - 2021;81(11):3105-3120. ดอย:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (รหัส:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M และคณะ การวิเคราะห์ภูมิประเทศรีดอกซ์และพลวัตในเซลล์ที่มีชีวิตและในร่างกายโดยใช้เซ็นเซอร์เรืองแสงที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม แนท โพรโทค - 2018;13(10):2362-2386. ดอย:10.1038/s41596-018-0042-5 (ไอเอฟ:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X และคณะ การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของเซลล์มะเร็งปอดเผยให้เห็นบทบาทสำคัญของ BCAT1 ในการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง เทอราโนสติกส์ 2021;11(19):9705-9720. Published 2021 Sep 27. doi:10.7150/thno.61731 เผยแพร่เมื่อ 27 กันยายน 2021 (รหัส:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y และคณะ โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ Uterus globulin 1 (UGRP1) จับกับ podoplanin (PDPN) เพื่อส่งเสริมเส้นทางการอักเสบใหม่ในระหว่างการติดเชื้อ Streptococcus pneumoniae คลินิกทรานสล เมด 2022;12(6):e850. ดอย:10.1002/ctm2.850 (รหัส:11.492)
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P และคณะ เส้นทางการส่งสัญญาณ MTOR ควบคุมการแยกตัวของแมคโครฟาจจากเซลล์ตั้งต้นไมอีลอยด์ของหนูโดยการยับยั้งออโทฟาจี ออโตฟาจี . 2019;15(7):1150-1162. ดอย:10.1080/15548627.2019. 1578040 (ไอเอฟ:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W และคณะ SNX10 (การเรียงลำดับเน็กซิน 10) ยับยั้งการเริ่มต้นและการดำเนินของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักโดยควบคุมการย่อยสลาย SRC โดยวิธีออโตฟาจิก ออโตฟาจี . 2020;16(4):735 -749. ดอย:10.1080/15548627.2019.1632122 (ไอเอฟ:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X และคณะ MK2 ส่งเสริมการย่อยสลาย Tfcp2l1 ผ่านทาง β-TrCP ubiquitin ligase เพื่อควบคุมการต่ออายุเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนของหนู ผู้แทนเซลล์ - 2021;37(5):109949. ดอย:10.1016/j.celrep.2021.109949 (ไอเอฟ:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y และคณะ การฟอสโฟรีเลชันที่เกิดจาก AMPK บน 53BP1 ส่งเสริม c-NHEJ ผู้แทนเซลล์ - 2021;34(7):108713. ดอย:10.1016/j.celrep.2021.108713 (ไอเอฟ:9.423)
(14) ซัน Q, Ye Y, Gui A และคณะ มอร์ทาลิน-แคลิฟอร์เนีย 2+ แกนขับเคลื่อนความต้านทานต่อริทูซิแมบโดยกำเนิดในมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดเซลล์ B ขนาดใหญ่ที่แพร่กระจาย มะเร็ง เล็ตต์ - 2022;537:215678. ดอย:10.1016/j.canlet.2022.215678 (ถ้า:8.679)
[15] Jin R, Zhao A , Han S และคณะ ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง S100A16 และ GRP78 มีผลต่อเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมโดยอาศัยความเครียดผ่านทางเส้นทาง IRE1α/XBP1 ในพังผืดในท่อไตและเนื้อเยื่อระหว่างหลอดไต การตายของเซลล์ . 2021;12(10):942. เผยแพร่เมื่อวันที่ 13 ตุลาคม 2021 doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (ถ้า:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y และคณะการยูบิควิติเนชันที่เชื่อมโยงกับ K63 ของ DYRK1A ช่วยบรรเทาการสลายตัวของ EGFR ที่เกิดจาก TRAF2 Sprouty 2 การตายของเซลล์ . 2021;12(6):608. เผยแพร่เมื่อวันที่ 11 มิถุนายน 2021 doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (ถ้า:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J การน็อคดาวน์ OLR1 ทำให้กระบวนการเผาผลาญไกลโคไลซิสอ่อนแอลงเพื่อยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่และการดื้อต่อเคมีบำบัดโดยการลดระดับ SULT2B1 ลงผ่าน c-MYC การตายของเซลล์ 2021;13(1):4. เผยแพร่เมื่อวันที่ 17 ธันวาคม 2021 doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (ถ้า:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M และคณะ โปรตีนฟอสฟาเทส PPM1A ดีฟอสโฟรีเลตและกระตุ้น YAP เพื่อควบคุมการสร้างใหม่ของลำไส้และตับในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม พีโลส ไบโอล . 2021; 19(2):e3001122 เผยแพร่เมื่อวันที่ 25 กุมภาพันธ์ 2021 doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (ถ้า:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C ยับยั้งการจำลองแบบของไวรัสเริมชนิดที่ 1 โดยควบคุมการกระจาย NRF2 ภายในเซลล์ ยาสมุนไพร. 2024 ก.พ.;124:155308. doi: 10.1016/จ.พ.ม.2023.155308. (ถ้า:7.9-
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. การถอดรหัสศักยภาพในการแพร่กระจายและการบำบัดแบบเสริมหลังการผ่าตัดที่เหมาะสมที่สุดของมะเร็งผิวหนังตามคะแนนการแพร่กระจาย การค้นพบการตายของเซลล์. 25 ต.ค. 2023;9(1):397. doi: 10.1038/ส41420-023-01678-6. (ถ้า:7.0-
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
| ชื่อสินค้า | แมว# | ข้อมูลจำเพาะ |
| ซิโปรฟลอกซาซิน ไฮโดรคลอไรด์ | 60201ES05/25/60 | 5/25/100กรัม |
| แอมพิซิลลิน โซเดียมซอลท์ | 60203ES10/60 | 10/100กรัม |
| ดอกซีไซคลินไฮเคลต | 60204ES03/08/25 | 1/5/25กรัม |
| คลอแรมเฟนิคอล เกรด USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100กรัม |
| คาเนมัยซินซัลเฟต | 60206ES10/60 | 10/100กรัม |
| เตตราไซคลิน HCl เตตราไซคลินไฮโดรคลอไรด์ (USP) | 60212ES25/60 | 25/100กรัม |
| แวนโคไมซินไฮโดรคลอไรด์ | 60213ES60/80/90 | 100มก./1ก./5ก. |
| เกลือเจนตามัยซินซัลเฟต | 60214ES03/08/25 | 1/5/25กรัม |
| สเปกติโนไมซิน ไฮโดรคลอไรด์ | 60215ES08 | 5กรัม |
| เฟลโอไมซิน (20 มก./มล. ในสารละลาย) | 60217ES20/60 | 20/5×20มก. |
| บลาสติซิดิน เอส (บลาสติซิดิน) | 60218ES10/60 | 10/10×10มก. |
| ไนสแตติน | 60219ES08 | 5กรัม |
| G418 ซัลเฟต (เจเนติซิน) | 60220ES03/08 | 1/5กรัม |
| พูโรไมซิน (สารละลาย 10 มก./มล.) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 มล. |
| พูโรไมซิน ไดไฮโดรคลอไรด์ | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 มก. / 1 ก. |
| ไฮโกรไมซิน บี (50 มก./มล.) | 60224ES03 | 1 กรัม (20 มล.)/10×1 กรัม (20 มล.) |
| ไฮโกรไมซิน บี | 60225ES03/10 | 1/10กรัม |
| อีริโทรไมซิน | 60228ES08/25 | 5/25กรัม |
| ทิเมนติน | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2กรัม |
| ออเรโอบาซิดิน เอ (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1มก. |
| โพลีมิกซินบีซัลเฟต | 60242ES03/10 | 1/10หมู่ |