Deoxyribonuclease I (DNase I) เป็นเอ็นโดนิวคลีเอสชนิดหนึ่ง ซึ่งไม่เพียงแต่ใช้รักษาความสมบูรณ์ของ RNA เท่านั้น แต่ยังใช้วิเคราะห์รอยเท้าของ DNA การสร้างไลบรารี DNA แบบสุ่ม การลดความเหนียวในไลเสทของเซลล์หรือสารสกัดโปรตีน เป็นต้น กล่าวโดยสรุป DNase I สามารถใช้ได้ในเกือบทุกแอปพลิเคชันที่ต้องมีการแยก DNA ด้วยเอนไซม์ ต่อไปนี้เป็นคำอธิบายโดยละเอียดเกี่ยวกับ DNase I และการใช้งานเฉพาะของมัน

1. DNAse I คืออะไร?
2. DNase I สำหรับการเตรียมการสกัด RNA ที่ปราศจาก DNA
3. DNase I สำหรับการถอดรหัสในหลอดทดลองเพื่อกำจัดเทมเพลตดีเอ็นเอ
4. DNase I สำหรับการกำจัด rRNA
5. DNase I สำหรับการติดฉลาก DNA
6. การใช้งานอื่น ๆ
7. คำแนะนำการเลือกผลิตภัณฑ์ DNase I

1. DNAse I คืออะไร?

ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (ดีเอ็นเอส I) เป็นเอ็นโดนิวคลีเอสแบบไม่จำเพาะที่สามารถย่อยดีเอ็นเอสายเดี่ยวหรือสายคู่ ซึ่งมีอยู่ในเนื้อเยื่อและของเหลวในร่างกายที่แตกต่างกัน เอ็นโดนิวคลีเอสสามารถไฮโดรไลซ์พันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์เพื่อผลิตโมโนและโอลิโกดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ที่มีหมู่ฟอสเฟต 5' และหมู่ฟอสเฟต 3' ช่วง pH การทำงานที่เหมาะสมของ DNase I คือ 7-8 กิจกรรมของเอ็นโดนิวคลีโอไทด์ขึ้นอยู่กับ Ca2+ และสามารถเปิดใช้งานได้โดยไอออนโลหะที่มีประจุไฟฟ้าสองขั้ว เช่น Mn2+, Mg2+, Zn2+ เป็นต้น ในสภาพที่มี Mg2+ เอ็นโดนิวคลีโอเอส I จะเฉือนบริเวณใดๆ ของดีเอ็นเอสายคู่แบบสุ่ม ในสภาพที่มี Mn2+ เอ็นโดนิวคลีโอเอส I สามารถเฉือนดีเอ็นเอสายคู่ที่ตำแหน่งเดียวกันเพื่อสร้างปลายทู่หรือปลายเหนียวของนิวคลีโอไทด์ 1-2 ปลายยื่นออกมา

รูปที่ 1 แผนผังแสดงการแยก dsDNA โดย DNase I ในสภาวะที่มี Mg2+ และ Mn2+

แม้ว่าโดยทั่วไปแล้ว การแยก DNase I จะถือว่าเป็นการแยกแบบไม่จำเพาะ แต่ DNase I มีแนวโน้มที่จะทำปฏิกิริยากับชิ้นส่วนลำดับบางชิ้น เช่น บริเวณร่องเล็ก และมีแนวโน้มที่จะทำปฏิกิริยากับลำดับพิวรีน-ไพริมิดีนมากกว่า อย่างไรก็ตาม เมื่อ DNase I ทำปฏิกิริยากับ dsDNA ที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน เบสทั้งสี่จะถูกตัดออก และผลกระทบต่อเบสเฉพาะตัวหนึ่งจะไม่เกิน 3 เท่าเมื่อเทียบกับเบสอื่นๆ

2. DNase I สำหรับการเตรียมการสกัด RNA ที่ปราศจาก DNA

ในการทดลองทางชีววิทยา ขั้นตอนแรกคือการเตรียมกรดนิวคลีอิกเพื่อศึกษาหน้าที่ต่างๆ ของ RNA อย่างไรก็ตาม เนื่องจาก DNA และ RNA มักถูกปล่อยออกมาพร้อมกันในระหว่างกระบวนการไลซิสเซลล์ จึงไม่สามารถหลีกเลี่ยงการรบกวนของทั้งสองได้ ไม่ว่าจะใช้สารละลายสกัดชนิดใดก็ตาม ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้เอนไซม์เฉพาะเพื่อขจัดการรบกวนดังกล่าว สำหรับการสกัด RNA คุณภาพสูง จะใช้ DNase I เพื่อขจัด DNA ที่เหลือออกจากตัวอย่าง

DNase I สามารถย่อยสลาย DNA สายคู่และสายเดี่ยวเป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์และนิวคลีโอไทด์เดี่ยวได้ และ DNA ในผลิตภัณฑ์เตรียม RNA ก็สามารถย่อยสลายได้อย่างมีประสิทธิภาพ จากนั้น DNase I จะถูกทำให้ไม่ทำงานโดยการให้ความร้อนด้วยบัฟเฟอร์หยุด ในระหว่างกระบวนการให้ความร้อน โครงสร้างกิ๊บของโมเลกุล RNA จะสามารถเปิดออกได้ ซึ่งทำให้ RNA เข้าสู่กระบวนการถอดรหัสย้อนกลับได้โดยตรง
คุณภาพของ RNA จะส่งผลโดยตรงต่อข้อมูลการทดลองในระดับสูง โดยทั่วไปแล้ว ไม่สามารถหลีกเลี่ยงสารตกค้างของ gDNA ได้อย่างสมบูรณ์ในระหว่างการสกัด RNA ดังนั้นโดยทั่วไปจึงแนะนำให้บำบัดตัวอย่าง RNA ด้วย DNase I เพื่อย่อย gDNA ที่เหลือก่อนการประยุกต์ใช้ในขั้นตอนต่อไป (เช่น การวิเคราะห์การแสดงออกของ mRNA การวิเคราะห์ทรานสคริปโทม เป็นต้น) ขั้นตอนย่อย gDNA สามารถดำเนินการได้ในระหว่างการสกัด RNA หลังการสกัด RNA หรือก่อนการถอดรหัสย้อนกลับของ RNAตามการวางตำแหน่งผลิตภัณฑ์ ผลิตภัณฑ์ที่จัดให้โดย Yeasen มีดังนี้:

ตารางที่ 1: รายการผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับการกำจัด DNA จากการสกัด RNA หรือ ก่อนการถอดรหัสย้อนกลับ

3. DNase I สำหรับการถอดรหัสในหลอดทดลองเพื่อกำจัดเทมเพลตดีเอ็นเอ

การถอดรหัสในหลอดทดลอง (In vitro transcription: IVT) จะใช้ DNA เป็นแม่แบบเป็นหลัก บวกกับซับสเตรตและบัฟเฟอร์ที่เกี่ยวข้องเพื่อรับ RNA ผ่านการถอดรหัสในหลอดทดลอง การทดลองถอดรหัสในหลอดทดลอง มักใช้ RNA โพลิเมอเรส เช่น T7, T3 และ SP6 สำหรับการสังเคราะห์ RNA RNA ที่สังเคราะห์อาจมีสารตกค้างของ DNA การกำจัดสารตกค้างของ DNA จะเป็นประโยชน์ต่อการพัฒนาการทดลองต่อเนื่อง ตัวอย่างเช่น ในขั้นตอนการพัฒนาวัคซีน mRNA การกำจัดสารตกค้างเป็นขั้นตอนที่สำคัญ ซึ่งสามารถลดความยากของการทำให้บริสุทธิ์ต่อเนื่องและเพิ่มความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ได้ โดยทั่วไป เทมเพลต DNA จะถูกกำจัดโดยใช้ Recombinant DNase I (ปราศจาก RNase)ตามกระบวนการสังเคราะห์ mRNA ผลิตภัณฑ์ที่จัดทำโดย Yeasen มีดังนี้: