นักวิทยาศาสตร์ใช้เอนไซม์ชนิดใดในการจับกับยีนใหม่? ไม่ต้องบอกก็รู้ว่ามี DNA ligase รวมอยู่ด้วย แล้วทำไม DNA ligase จึงมีความสำคัญใน DNA รีคอมบิแนนท์? เนื่องจาก DNA ligase มีหน้าที่ในการจับชิ้นส่วนเป้าหมายเข้ากับเวกเตอร์ ซึ่งเป็นหนึ่งในองค์ประกอบสำคัญที่กำหนดความสำเร็จของการทดลอง ในฐานะของ DNA ligase ชนิดหนึ่ง DNA ligase T4 มีบทบาทอย่างไรในการทดลองโคลนโมเลกุล? มันทำงานอย่างไร? ต่อไปเราจะแนะนำ DNA ligase T4 อย่างละเอียด

1. T4 DNA Ligase คืออะไร?
2. T4 DNA ligase มีหน้าที่อะไร?
3. Yeasen Biotech T4 DNA ligase สามารถนำมาใช้สำหรับการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ NGS ได้
4. คำแนะนำในการเลือก Yeasen ไบโอเทค T4 DNA ไลเกส

1. T4 DNA Ligase คืออะไร?

เอนไซม์ไลเกสดีเอ็นเอ T4 เป็นเอนไซม์ไลเกสที่ขึ้นกับเอทีพีซึ่งเร่งปฏิกิริยาการลิเกชันระหว่างโมเลกุลดีเอ็นเอ โดยเอนไซม์นี้จะสร้างฟอสโฟไดเอสเทอร์โดยเชื่อมปลาย 3'-ไฮดรอกซิลและ 5'-ฟอสเฟตเข้าด้วยกัน เอนไซม์ไลเกสดีเอ็นเอมีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการจำลองและซ่อมแซมดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตทุกชนิด เอนไซม์ไลเกสดีเอ็นเอ T4 ที่เข้ารหัสด้วยฟาจถูกสร้างขึ้นระหว่างการติดเชื้อฟาจ T4 ของอีโคไล
ลิเกสที่ใช้ในการตัดต่อพันธุกรรม ได้แก่ ไลเกสดีเอ็นเอของอีโคไลและไลเกสดีเอ็นเอของที4 โดยไลเกสดีเอ็นเอของที4 เป็นที่นิยมใช้กันมากขึ้นในปัจจุบัน ไลเกสดีเอ็นเอของที4 สามารถซ่อมแซมรอยหยักสายเดี่ยวบนดีเอ็นเอสายคู่ อาร์เอ็นเอสายคู่ หรือสายไฮบริดดีเอ็นเอ/อาร์เอ็นเอ เพื่อเชื่อมต่อนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกันสองตัว และมีบทบาทสำคัญในการซ่อมแซมและการรวมตัวใหม่ของดีเอ็นเอ
ในกระบวนการสร้างพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ สามารถใช้เอนไซม์ลิเกสดีเอ็นเอ T4 ร่วมกับเอนไซม์ตัดจำเพาะเพื่อทำให้การทดลองสร้างพลาสมิดรีคอมบิแนนท์เสร็จสมบูรณ์ได้ เอนไซม์นี้สามารถเร่งปฏิกิริยาการสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ระหว่างปลาย 5'-P และปลาย 3'-OH ของดีเอ็นเอสายคู่ และยังมีประสิทธิภาพในการเชื่อมต่อที่ดีสำหรับการเชื่อมต่อปลายเหนียวและปลายทื่อ

รูปที่ 1 กลไกการทำงานของ T4 dna ligase

2. T4 DNA ligase มีหน้าที่อะไร?

2.1 การสร้างเวกเตอร์

ในการทดลองสร้างเวกเตอร์ เอนไซม์จำกัดชนิดต่างๆ สามารถผลิตปลายได้หลายประเภท สำหรับปลายที่แตกต่างกัน ไลเกส DNA T4 จะมีกลยุทธ์การผูกที่แตกต่างกัน

2.1.1 การโคลนนิ่งด้วยเอนไซม์จำกัดเอนไซม์ซึ่งเป็นปลายเหนียวที่ผลิตโดยการย่อยแบบเดี่ยว

ในระหว่างการสร้างเวกเตอร์ หากใช้เอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสตัวเดียวกันในการตัดชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนเป้าหมาย และโมเลกุลเวกเตอร์สามารถผลิตปลายเหนียวเดียวกันได้ เอนไซม์ไลเกสดีเอ็นเอ T4 สามารถทำการเชื่อมต่อการรวมตัวกันใหม่ได้โดยตรง อย่างไรก็ตาม เนื่องจากปลายเหนียวเหมือนกัน จึงสามารถแทรกยีนเป้าหมายเข้าไปในเวกเตอร์ได้ในทิศทางไปข้างหน้าหรือข้างหลัง ซึ่งจะเพิ่มภาระงานในการคัดกรองโคลนการรวมตัวกันใหม่ที่ถูกต้องได้อย่างง่ายดาย พิจารณาใช้วิธีการย่อยเอนไซม์คู่สำหรับการสร้างเวกเตอร์
นอกจากนี้ ปลายที่ยึดติดกันของเวกเตอร์ที่เตรียมโดยการย่อยด้วยเอนไซม์ตัวเดียวสามารถจับคู่กันได้ จากนั้นพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์จะถูกสร้างขึ้นระหว่างนิวคลีโอไทด์ภายใต้การกระทำของ T4 DNA ligase ส่งผลให้เวกเตอร์สามารถผูกตัวเองได้ การใช้ฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ในการบำบัดเวกเตอร์ที่ย่อยแล้วสามารถกำจัดกลุ่มฟอสเฟตที่ปลาย 5' ของเวกเตอร์ได้ ทำให้เวกเตอร์ไม่สามารถผูกตัวเองได้ ดังนั้น ภายใต้การกระทำของ T4 DNA ligase เวกเตอร์และชิ้นส่วนเป้าหมายจะเชื่อมต่อกันเพื่อให้การสร้างเวกเตอร์รีคอมบิแนนท์เสร็จสมบูรณ์

2.1.2 การโคลนนิ่งด้วยเอนไซม์จำกัดเอนไซม์ซึ่งเป็นปลายเหนียวที่ผลิตโดยการย่อยแบบดับเบิลไดเจสต์

ในกระบวนการสร้างเวกเตอร์ หากใช้เอนไซม์จำกัดเอนไซม์สองตัวที่มีปลายเหนียวต่างกันในการย่อยชิ้นส่วนเป้าหมายและเวกเตอร์ตามลำดับ ก็จะสามารถสร้างปลายเหนียวที่แตกต่างกันได้สองแบบ ณ จุดนี้ ไลเกส DNA T4 สามารถผูกปลายเหนียวเดียวกันได้อย่างเลือกสรรเพื่อให้แน่ใจว่าชิ้นส่วนเป้าหมายถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์ในทิศทางที่ถูกต้อง เมื่อชิ้นส่วนเป้าหมายและเวกเตอร์ในรูปที่ 2 ถูกย่อยด้วย EcoR I และ BamH I ในเวลาเดียวกัน ก็จะสามารถเชื่อมต่อปลายเหนียวเดียวกันได้ มีทิศทางการผูกเพียงทิศทางเดียวระหว่างชิ้นส่วนเป้าหมายและเวกเตอร์

รูปที่ 2 การผูกปลายเหนียวที่เกิดจากการย่อยด้วยเอนไซม์สองตัว^[1]

2.1.3 การโคลนชิ้นส่วนจำกัดปลายทู่

เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัดบางชนิดสามารถสร้างปลายทู่ได้ในระหว่างการแยกเอนไซม์ เช่น Sma I และอื่นๆ ไลเกส DNA T4 สามารถสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ระหว่างเวกเตอร์และอินเสิร์ตได้โดยตรง และไม่จำเป็นต้องจับคู่ระหว่างเบส อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีประสิทธิภาพในการผูกต่ำและมีแนวโน้มที่จะผูกตัวเองด้วยเวกเตอร์ โดยทั่วไป ปลายทู่สามารถแปลงเป็นปลายเหนียวได้ จากนั้นจึงผูก ตัวอย่างเช่น การเพิ่มเบสโพลีเอและโพลีทีที่เสริมกันที่ปลายของชิ้นส่วนเป้าหมายและเวกเตอร์ และปลายเสริมที่เหนียวเทียมตามลำดับ จะช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการเชื่อมต่อด้วยเทอร์มินัลดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทดิลทรานสเฟอเรส

2.1.4 การโคลน TA

เวกเตอร์ T ที่ใช้ในการโคลน TA มีโอเวอร์แฮง T ที่ปลาย 3' เมื่อลำดับ DNA ของชิ้นส่วนเป้าหมายไม่ชัดเจน ชิ้นส่วนยีนเป้าหมายสามารถเชื่อมต่อกับเวกเตอร์ T ได้โดยการโคลน TA และสามารถกำหนดยีนเป้าหมายได้โดยการจัดลำดับ โพลิเมอเรส DNA ของ Taq ที่ใช้ใน PCR มีกิจกรรมเทอร์มินัลทรานสเฟอเรสและสามารถเพิ่มนิวคลีโอไทด์ "A" ลงในปลาย 3' ของชิ้นส่วน DNA ได้ ไลเกส DNA ของ T4 สามารถเชื่อมต่อผลิตภัณฑ์ที่ขยายโดยโพลิเมอเรส DNA ของ Taq เข้ากับเวกเตอร์ T ได้โดยตรง และผลิตภัณฑ์ที่ขยายด้วย PCR สามารถบรรลุวัตถุประสงค์ของการโคลนที่มีประสิทธิภาพได้โดยไม่ต้องเพิ่มอะแดปเตอร์เทียม

รูปที่ 3 เวิร์กโฟลว์ของการโคลน TA^[2]

2.2 การผูกอะแดปเตอร์ NGS

ในระหว่างการสร้างไลบรารีการจัดลำดับรุ่นถัดไป จำเป็นต้องเชื่อมต่ออะแดปเตอร์เทียมกับผลิตภัณฑ์ PCR ก่อนที่จะสามารถติดไว้บนเซลล์ไหลบนชิปการจัดลำดับเพื่อให้การจัดลำดับเสร็จสมบูรณ์ การสร้างไลบรารีตัวเชื่อมแบบผูกมัดโคลน TA เป็นวิธีการทางเทคนิคทั่วไปมาก และหลักการของมันก็คล้ายกับการโคลน TA ที่กล่าวถึงข้างต้น หลังจากที่ชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการจัดลำดับถูกฟอสโฟรีเลตที่ปลาย 5' และ "A" ถูกเพิ่มที่ปลาย 3' มันจะเสริมและจับคู่กับอะแดปเตอร์ที่มีปลายเหนียว "T" จากนั้นสายคู่ที่สมบูรณ์จะถูกสร้างขึ้นและจัดลำดับโดยเครื่องจักร
ในระหว่างการผูก TA ประเภทตัวอย่างที่แตกต่างกันหรือความซับซ้อนของโครงสร้างชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกจะส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพของการผูก ดังนั้นอะแดปเตอร์ของแพลตฟอร์มที่แตกต่างกันจะมีผลกระทบต่อผลลัพธ์ของไลบรารีขั้นสุดท้ายด้วยเช่นกัน
ตัวอย่างเช่น อะแดปเตอร์ Bubble ของแพลตฟอร์ม MGI มีโครงสร้างรองพิเศษและต้องการประสิทธิภาพการเชื่อมต่อที่สูงมากสำหรับไลเกส DNA T4 และการลดลงของประสิทธิภาพการเชื่อมต่อส่งผลโดยตรงต่อเอาต์พุตของไลบรารี

รูปที่ 4 กระบวนการผูกอะแดปเตอร์ทั่วไป

3. Yeasen Biotech T4 DNA ligase สามารถนำมาใช้สำหรับการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ NGS ได้

Yeasen ไบโอเทคที่พัฒนาเป็นพิเศษ ดีเอ็นเอไลเกส T4 เร็ว สำหรับการเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA และอะแดปเตอร์ในกระบวนการสร้างห้องสมุด NGS เอนไซม์มีความสามารถในการเชื่อมต่อที่มีประสิทธิภาพ ไม่เพียงแต่ความเร็วในการเชื่อมต่อที่รวดเร็วเท่านั้น แต่ยังเข้ากันได้กับตัวอย่างประเภทต่างๆ อีกด้วย ซึ่งมีประโยชน์มากกว่าสำหรับการเชื่อมต่อชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกกับโครงสร้างที่ซับซ้อน ปัจจุบัน ได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับปริมาณงานสูงของลูกค้าจำนวนมาก สำหรับการเชื่อมต่ออะแดปเตอร์ Bubble บนแพลตฟอร์ม MGI ยังสามารถได้รับคุณภาพการจัดลำดับที่ยอดเยี่ยมอีกด้วย

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase ที่มีประสิทธิภาพการเชื่อมต่อสูงเป็นพิเศษ

ใช้ Yeasen ไบโอเทค ฟาสต์ ที4 ดีเอ็นเอ ไลเกส เพื่อสร้างไลบรารีที่มีอะแดปเตอร์ประเภทต่างๆ ตัวอย่างคือ 170 bp cfDNA เลียนแบบ และใช้ไลบรารี Agilent 2100 เพื่อตรวจจับผลลัพธ์ ①ผลิตภัณฑ์อะแดปเตอร์ที่ไม่เชื่อมต่อ ②ผลิตภัณฑ์อะแดปเตอร์ปลายเดียว ③ผลิตภัณฑ์อะแดปเตอร์ปลายคู่ ④อะแดปเตอร์ที่เหลือ จากผลลัพธ์ จะเห็นได้ว่าประสิทธิภาพการเชื่อมต่อของอะแดปเตอร์ปลายเดียวและปลายคู่สูงมาก

รูปที่ 5 ผลิตภัณฑ์รัดท่อชนิดต่างๆ ที่ตรวจพบด้วยเครื่อง Agilent 2100

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase ให้ผลผลิตห้องสมุดที่ยอดเยี่ยม

การใช้ Fast T4 DNA ligase สำหรับการสร้างไลบรารีประเภทต่างๆ เมื่อเปรียบเทียบกับ T4 DNA ligase อื่นๆ พบว่าผลผลิตของไลบรารีจะดีกว่า

ตารางที่ 1 ผลผลิตตัวอย่างประเภทต่างๆ ของห้องสมุด

4. คำแนะนำในการเลือก Yeasen ไบโอเทค T4 DNA ไลเกส

Yeasen เป็นบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพที่ดำเนินการวิจัย พัฒนา ผลิต และจำหน่ายรีเอเจนต์ชีวภาพหลักสามชนิด ได้แก่ โมเลกุล โปรตีน และเซลล์ นอกจาก Fast T4 DNA ligase แล้ว Yeasen ไบโอเทคก็มี ดีเอ็นเอไลเกส T4 แบบใหม่ และ ดีเอ็นเอไลเกส T4 ด่วน ให้เลือก โดยสามารถเลือกได้ตามแอพพลิเคชั่นที่แสดงในตารางต่อไปนี้:

ตารางที่ 2: สินค้าที่เกี่ยวข้อง

อ้างอิง

[1] W. Yuan. Gene Engineering[M]. สำนักพิมพ์อุตสาหกรรมเคมี, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. การโคลนยีนเพื่อชีววิทยาสังเคราะห์ - ScienceDirect[J] ชีววิทยาโมเลกุล (ฉบับที่สาม) 2019:199-239
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM และคณะ DNA Ligases: โครงสร้าง กลไกการเกิดปฏิกิริยา และฟังก์ชัน[J] Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699
[4] Shuman S. DNA Ligases: ความก้าวหน้าและแนวโน้ม[J] วารสารเคมีชีวภาพ 2009, 284(26):17365-17369