รูปที่ 1 แผนผังของ DNase I ที่ตัด dsDNA ในสภาพที่มี Mg²⁺ และแมงกานีส²⁺

Common DNase I ได้รับการทำให้บริสุทธิ์จากตับอ่อนของวัวเป็นหลักหรือเป็นเอนไซม์รีคอมบิแนนท์ เมื่อเปรียบเทียบกับ DNase I ที่บริสุทธิ์จากตับอ่อนของวัวแล้ว DNase I รีคอมบิแนนท์จะมีระดับ RNase ภายในร่างกายที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกัน หรือสามารถกำหนดสูตรเป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่มี RNase ได้ ทำให้เหมาะสำหรับการใช้งานที่ไวต่อ RNase มากกว่า เช่น การแยก DNA ออกจากตัวอย่าง RNA

แอปพลิเคชั่น

ในส่วนของการใช้งาน DNase I เป็นที่รู้จักกันดีในการใช้งานที่เกี่ยวข้องกับการรักษาความสมบูรณ์ของ RNA เช่น การสกัด RNA ที่ไม่มี DNA การเตรียมเทมเพลต RNA ที่ไม่มี gDNA ก่อนการถอดรหัสย้อนกลับ และการย่อยสลายเทมเพลต DNA หลังจากการถอดรหัสในหลอดทดลอง นอกจากนี้ ยังสามารถใช้เพื่อย่อยโพรบ DNA ในการกำจัด rRNA สำหรับการติดฉลาก DNA ผ่านการแปลนิก การวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DNA กับโปรตีนโดยใช้วิธีการสร้างรอยประทับ การสร้างไลบรารี DNA แบบสุ่ม การลดความหนืดของไลเสทของเซลล์หรือสารสกัดโปรตีน การย่อยการยึดเกาะของเซลล์เป็นสารเติมแต่งในการเพาะเลี้ยงเซลล์ และการแยก DNA ของจีโนมบางส่วนเป็นตัวควบคุมเชิงบวกในการทดสอบ TUNEL เพื่อการตรวจจับอะพอพโทซิส โดยสรุปแล้ว DNase I สามารถใช้ได้ในเกือบทุกการใช้งานที่ต้องมีการย่อย DNA ด้วยเอนไซม์ ด้านล่างนี้จะเป็นการแนะนำสั้นๆ เกี่ยวกับการใช้งานทั่วไปหลายๆ รายการ

• การกำจัด gDNA ก่อนการสกัด RNA หรือการถอดรหัสย้อนกลับ

RNA ซึ่งเป็นตัวอย่างที่มักศึกษากันในห้องปฏิบัติการ มีอิทธิพลอย่างมากต่อคุณภาพของข้อมูลการทดลองเนื่องจากคุณภาพของตัวมันเอง โดยทั่วไปแล้ว การหลีกเลี่ยง gDNA ที่เหลือในระหว่างกระบวนการสกัด RNA นั้นเป็นไปไม่ได้เลย ดังนั้น ก่อนดำเนินการประยุกต์ที่ท้าทาย (เช่น การวิเคราะห์การแสดงออกของ mRNA การวิเคราะห์ทรานสคริปโทม เป็นต้น) มักแนะนำให้บำบัดตัวอย่าง RNA ด้วย DNase I เพื่อย่อย gDNA ที่เหลือ การย่อย gDNA สามารถทำได้ระหว่างการสกัด RNA หลังการสกัด RNA หรือก่อนการถอดรหัสย้อนกลับของ RNA

รูปที่ 2. กระบวนการกำจัด gDNA ที่ใช้ DNase I

• การกำจัดแม่แบบดีเอ็นเอในการถอดรหัสในหลอดทดลอง

การถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT) ใช้ DNA เป็นแม่แบบในการผลิต RNA โดยได้รับอิทธิพลจากซับสเตรตและบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม RNA polymerase ที่ใช้กันทั่วไปในกระบวนการนี้ ได้แก่ T7, T3 และ SP6 ซึ่งมีหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ RNA อย่างไรก็ตาม ผลิตภัณฑ์ RNA ที่สังเคราะห์อาจมีสารตกค้างของ DNA และการกำจัดสารตกค้างเหล่านี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการทดลองภายหลัง

โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกระบวนการพัฒนาวัคซีน mRNA การกำจัดสารตกค้างของ DNA เหล่านี้ถือเป็นขั้นตอนสำคัญที่ส่งผลโดยตรงต่อความยากของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ในภายหลังและความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายเพื่อกำจัดเทมเพลต DNA อย่างมีประสิทธิภาพ โดยทั่วไปจะใช้ DNase I ในการบำบัดเพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่าง RNA ปราศจากสารตกค้างของ DNA ซึ่งเป็นขั้นตอนที่จะช่วยปรับปรุงความแม่นยำและประสิทธิภาพโดยรวมของการทดลอง

รูปที่ 3: กระบวนการถอดรหัสในหลอดทดลองโดยใช้พลาสมิดเชิงเส้นเป็นแม่แบบ^[4]

• การกำจัด rRNA ในการสร้างและจัดลำดับคลัง RNA

ในสิ่งมีชีวิต rRNA มีอยู่มากมายและถูกเก็บรักษาไว้เป็นอย่างดี ซึ่งไม่มีความสำคัญมากนักสำหรับการวิจัยข้อมูลทางชีววิทยา อย่างไรก็ตาม 95% ของ RNA ทั้งหมดที่สกัดได้ระหว่างการทดลองคือ rRNA ของมนุษย์ และการมีอยู่ของ rRNA เหล่านี้อาจขัดขวางการตรวจจับ RNA เป้าหมาย ดังนั้น ในการเตรียมและจัดลำดับไลบรารี RNA มักจะกำจัด rRNA ก่อน ปัจจุบัน วิธีหลักในการกำจัด rRNA คือการย่อย RNAase และการทำงานหลักของ rRNA ขั้นตอนและหลักการมีดังนี้:

1. สารสกัด RNA ทั้งหมด;
2. ผสมพันธุ์โพรบ DNA สายเดี่ยวกับโมเลกุล rRNA (หมายเหตุ: ออกแบบและสังเคราะห์โพรบ DNA สายเดี่ยวเฉพาะ rRNA)
3. RNase H ย่อยสลาย rRNA ไฮบริดไดซ์
4. DNase I ย่อยสลายโพรบ DNA
5. rRNA ถูกกำจัดออกได้สำเร็จ โดยทิ้งเทมเพลต RNA ที่ไม่ใช่ rRNA ไว้

รูปที่ 4: แผนผังของหลักการกำจัด rRNA โดยใช้เอนไซม์^[5]

• การแปลอักษรสำหรับการติดฉลาก DNA

การแปลนิกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปที่สุดในการติดฉลากโพรบกรดนิวคลีอิกในห้องปฏิบัติการ วิธีนี้ทำได้โดยการทำงานร่วมกันของ DNase I และ อีโคไล ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ไอ.

หลักการสำคัญมีดังนี้:

1. ขั้นแรก ให้ใช้ DNase I ในความเข้มข้นที่เหมาะสมเพื่อสร้างรอยหยักสายเดี่ยวหลาย ๆ เส้นในแต่ละสายของ DNA สายคู่ที่จะติดฉลาก โดยสร้างปลาย 3' ไฮดรอกซิลที่ตำแหน่งรอยหยัก
2. จากนั้นใช้กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 5'→3' ของ อีโคไลDNA Polymerase I เพื่อกำจัดนิวคลีโอไทด์ออกจากปลาย 5' ของรอยบาก ในขณะที่กิจกรรมโพลีเมอเรส 5'→3' ของ อี. อีโคไล DNA Polymerase I จะนำนิวคลีโอไทด์ที่มีป้ายกำกับไปที่ปลาย 3' ของรอยบากเพื่อซ่อมแซม เมื่อรอยบากเคลื่อนไปตามสาย DNA นิวคลีโอไทด์ที่มีป้ายกำกับจะถูกผสมเข้ากับสาย DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่

รูปที่ 5: แผนผังหลักการติดฉลาก DNA โดยการแปลนิก^[6]

• การทดลองการทดสอบการสร้างรอยเท้า DNAse I

การทดสอบการสร้างรอยเท้าด้วย DNase I เป็นวิธีการที่แม่นยำในการระบุตำแหน่งการจับของโปรตีนที่จับกับ DNA บนโมเลกุล DNA หลักการคือ โปรตีนที่จับกับชิ้นส่วน DNA จะปกป้องบริเวณที่จับไม่ให้ถูกย่อยสลายโดย DNase I หลังจากย่อยด้วยเอนไซม์แล้ว ชิ้นส่วนที่เหลือ (หรือ "รอยเท้า") สามารถนำมาใช้เพื่อกำหนดลำดับของชิ้นส่วนนั้นได้ ในภาพเจล ไม่มีแถบที่สอดคล้องกับบริเวณที่โปรตีนถูกจับ

หลักการสำคัญมีดังนี้:

1. ติดฉลากปลายสายเดี่ยวของโมเลกุล DNA สายคู่ที่ต้องการทดสอบ
2. ผสมโปรตีนกับ DNA และเติม DNase I ในปริมาณที่เหมาะสมสำหรับการย่อยด้วยเอนไซม์ เพื่อสร้างชิ้นส่วน DNA ที่มีความยาวแตกต่างกันควรควบคุมปริมาณเอนไซม์เพื่อให้แน่ใจว่าชิ้นส่วน DNA ที่อยู่ติดกันมีความแตกต่างกันเพียงหนึ่งนิวคลีโอไทด์ และควรมีการรวมตัวควบคุมโดยไม่เติมโปรตีนเข้าไปควบคู่กัน
3. นำโปรตีนออกจาก DNA แยก DNA ที่ถูกทำลายสภาพด้วยอิเล็กโทรโฟเรซิส PAGE และออโตราดิโอแกรมเพื่อตีความลำดับนิวคลีโอไทด์ของบริเวณรอยเท้าโดยเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม

รูปที่ 6: แผนผังหลักการของการทดสอบการสร้างลายพิมพ์ DNase I^[7]

การ ดีเอ็นเอส ไอ คำแนะนำในการเลือก Yeasen

เพื่อตอบสนองความต้องการใช้งานที่หลากหลาย Yeasen ข้อเสนอ รีคอมบิแนนท์ ดีเอ็นเอส ไอ ใน อี.โคไลและสามารถให้ DNase I เกรด GMP เพื่อตอบสนองข้อกำหนดในการถอดรหัส mRNA ในหลอดทดลองและการใช้งานอื่นๆ

การจัดวางตำแหน่งผลิตภัณฑ์	แอปพลิเคชัน	ชื่อสินค้า	หมายเลขแคตตาล็อก
RNase ฟรี	การกำจัด DNA ออกจากการเตรียม RNA และโปรตีน	Recombinant DNase I (ปราศจาก RNase)	10325ES
เกรด GMP, RNase ฟรี	การถอดรหัส mRNA ในหลอดทดลอง	UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) เกรด GMP	10611ES

อ้างอิง

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L และคณะ การตรวจหา DNA ของไวรัส HPV, mRNA E6/E7 และ p16INK4a ในมะเร็งศีรษะและคอ: การทบทวนอย่างเป็นระบบและการวิเคราะห์อภิมาน[J] The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S และคณะ การเปรียบเทียบปริมาณ DNA ของไวรัสที่จำเพาะต่อชนิดเชื้อ HPV ก่อมะเร็งและการตรวจหา mRNA E6/E7 ในตัวอย่างปากมดลูก: ผลลัพธ์จากการศึกษาหลายศูนย์[J] วารสารไวรัสวิทยาทางการแพทย์ 2556, 85(3): 472-482

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. การเพิ่มประสิทธิภาพของการกำจัด Dnase I ของ DNA ที่ปนเปื้อนจาก RNA เพื่อใช้ใน RNA-PCR เชิงปริมาณ[J] Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. ความก้าวหน้าของ mRNA ที่ถอดรหัสในหลอดทดลอง (IVT mRNA) เพื่อให้สามารถแปลผลในคลินิกได้[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R และคณะ การทำให้ DNase I ไม่ทำงานด้วยความร้อนที่ไม่สามารถย้อนกลับได้โดยไม่ทำให้ RNA เสื่อมสลาย[J] Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256

[6] Adolph S, Hameister H. การแปลตำแหน่งในโครโมโซมเมตาเฟสด้วย d-UTP[J] ที่ติดฉลากด้วยไบโอติน Human genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. การเลือกวิธีการที่เหมาะสมสำหรับการระบุต้นกำเนิดการจำลองแบบในจีโนมของจุลินทรีย์ ฟรอนท์ไมโครไบโอล, 2015, 6: 1049.