RNase HII หรือที่รู้จักกันในชื่อ RNase H2 เป็นเอ็นโดริโบนิวคลีเอสที่กำหนดเป้าหมายและตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ที่ปลาย 5' ของไรโบนิวคลีโอไทด์เดี่ยวที่อยู่ภายในเฮลิกซ์ดีเอ็นเอสายคู่โดยเฉพาะ ซึ่งให้ฟอสเฟต 5' และกลุ่มไฮดรอกซิล 3' (รูปที่ 1) เอนไซม์นี้แสดงกิจกรรมการแตกตัวเพียงเล็กน้อยต่ออาร์เอ็นเอสายเดี่ยว และไม่ทำงานต่อดีเอ็นเอสายคู่ (dsDNA) และดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) RNase HII จะทำงานในช่วงอุณหภูมิ 50°C ถึง 75°C และจะถึงจุดสูงสุดที่อุณหภูมิระหว่าง 70°C ถึง 75°C ด้วยความสามารถพิเศษในการตัดแยกเฉพาะตำแหน่งที่ตำแหน่ง DNA ที่มีการผสานไรโบนิวคลีโอไทด์โดยไม่ส่งผลกระทบต่อ dsDNA หรือ ssDNA RNase HII จึงทำหน้าที่เป็น "ตัวกระตุ้น" ที่แม่นยำสำหรับการเริ่มปฏิกิริยา รวมถึงการกระตุ้นและการขยายไพรเมอร์ เพื่อให้ได้การขยายเฉพาะ เอนไซม์นี้มีบทบาทสำคัญใน RNase H-dependent PCR (rhPCR) เทคโนโลยีการขยายไอโซเทอร์มอลแบบลูปไกล่เกลี่ย (LAMP) และการย่อยสลายส่วนประกอบ RNA ในชิ้นส่วนโอคาซากิ

一. PCR แบบพึ่งพา RNase H-การตรวจ RhPCR-
rhPCR ผสมผสาน RNase HII และไพรเมอร์ rhPCR แบบปิดที่แยกออกได้ซึ่งออกแบบมาเป็นพิเศษเข้ากับกระบวนการ PCR แนวทางนี้ใช้ประโยชน์จากคุณสมบัติเฉพาะตัวของ RNase HII ในการไฮโดรไลซ์ RNA อย่างเลือกสรรภายในไฮบริด DNA-RNA ในขณะที่ยังคงรักษาพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ใน DNA และ RNA สายเดี่ยวหรือสายคู่ไว้ เป็นผลให้ RNase HII ย่อยเฉพาะไฮบริด DNA-RNA และอนุญาตให้ขยายไพรเมอร์ได้เมื่อไพรเมอร์นั้นเข้ากันได้อย่างสมบูรณ์แบบกับลำดับ DNA เป้าหมาย การกระทำที่กำหนดเป้าหมายนี้ช่วยเพิ่มความแม่นยำของปฏิกิริยาได้อย่างมาก RNase HII เป็นเอนไซม์ตัวเดียวที่สามารถเริ่มต้นการกำจัดไรโบนิวคลีโอไทด์ได้อย่างแม่นยำโดยไม่ก่อให้เกิดการกลายพันธุ์โดยการแยกที่ปลาย 5' ของกรดนิวคลีอิกไรโบ เนื่องจากมีความจำเพาะ ความไว และความสามารถในการทำซ้ำได้สูง rhPCR จึงมีข้อได้เปรียบที่ชัดเจนในแอปพลิเคชันต่างๆ เช่น การตรวจหา SNP (polymorphism ของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว) การพิมพ์ยีน การตรวจหาเป้าหมายหลายรายการพร้อมกัน และการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกในสิ่งแวดล้อม

เส้นทางเทคนิค

1. ไพรเมอร์ดีไซน์

การออกแบบไพรเมอร์ต้องแน่ใจว่าอุณหภูมิการหลอมเหลวหลังการตัดจะสูงกว่าอุณหภูมิการอบอ่อนเพื่อให้แน่ใจว่าไพรเมอร์จะจับกับเทมเพลตได้อย่างเสถียรระหว่างรอบ PCR ไพรเมอร์ rhPCR ประกอบด้วยสามส่วน:

1）ส่วน DNA ขนาด 5': มีความยาวและอุณหภูมิการหลอมเหลว (Tm) ที่เทียบเคียงได้กับไพรเมอร์ PCR มาตรฐาน จึงสามารถจับคู่และขยายจาก DNA เทมเพลตได้อย่างมีประสิทธิภาพหลังจากถูกตัดด้วยเอนไซม์ RNase HII

2）เบส RNA เดี่ยว: ทำหน้าที่เป็นไซต์การตัดสำหรับ RNase HII

3）ส่วน DNA แบบ 3': มีความยาวสี่หรือห้าเบสพร้อมตัวบล็อก โดยทั่วไปจะเป็นโมเลกุลสั้นที่ไม่สามารถขยายได้ เช่น โพรพิลีนไกลคอล ซึ่งป้องกันไม่ให้ DNA โพลิเมอเรสขยายตัวจนกว่าตัวบล็อกจะถูกกำจัดออก

2.การตัดและการต่อขยาย

ในช่วงเริ่มต้นของปฏิกิริยา rhPCR ไพรเมอร์และดีเอ็นเอแม่แบบจะเป็นอิสระ เมื่อไพรเมอร์จับกับดีเอ็นเอแม่แบบเฮเทอโรดูเพล็กซ์ RNA:DNA ที่เฉพาะเจาะจง เบส 5' ของดีเอ็นเอของไพรเมอร์ที่ถูกบล็อกจะถูกระบุและตัดออกโดยเอนไซม์ RNase HII ทิ้งโอลิโกนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอที่มีกลุ่ม 3'-ไฮดรอกซิล ซึ่งเป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการขยายดีเอ็นเอโพลีเมอเรส จากนั้นจึงตามด้วยกระบวนการขยาย PCR ทั่วไป

รูปที่ 2 แผนภาพหลักการ rhPCR ^[1]

สอง.การขยายไอโซเทอร์มอลแบบลูป-ตัวกลาง (LAMP)

การขยายยีนแบบไอโซเทอร์มอลแบบลูปมีตัวกลาง (LAMP) เป็นวิธีการขยายยีนที่ง่ายและรวดเร็วซึ่งสามารถขยายกรดนิวคลีอิกภายใต้สภาวะไอโซเทอร์มอลได้ภายในระยะเวลาสั้นๆ อย่างไรก็ตาม เนื่องมาจากการเริ่มต้นของกิจกรรมดีเอ็นเอโพลีเมอเรสระหว่างการเตรียมที่อุณหภูมิห้อง จึงเกิดความไม่ตรงกันแบบไม่จำเพาะ ซึ่งอาจทำให้เกิดการจับคู่ผิดและไพรเมอร์ไดเมอร์ในปริมาณเล็กน้อย ส่งผลให้เกิดการปนเปื้อนเล็กน้อยซึ่งอาจส่งผลให้เกิดผลบวกปลอม
การนำ RNase HII มาใช้กับระบบขยายสัญญาณ LAMP สามารถแก้ไขปัญหาของผลบวกปลอมในเทคโนโลยี LAMP ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และขยายขอบเขตการใช้งานในการวินิจฉัยทางคลินิก ดังที่แสดงในรูปที่ 3 วิธี LAMP ที่กระตุ้นด้วยไพรเมอร์ (PA-LAMP) โดยใช้ RNase HII เมื่อไพรเมอร์จับคู่กับ ssDNA เป้าหมาย เอนไซม์ RNase HII จะแยก RNA บนไพรเมอร์โดยเฉพาะ ทำให้ไพรเมอร์ทำงานและขยายสัญญาณ ทำให้ไพรเมอร์ขยายตัวได้อย่างเฉพาะเจาะจงและลดผลบวกปลอมในระบบได้อย่างมีประสิทธิภาพ

Yeasen อาร์นาส เอชไอไอ

Yeasenอาร์นาส เอชไอไอ (แมว#14539) ได้มาจาก ไพโรคอคคัส อะบิสซิ, Paและปราศจากการปนเปื้อนของนิวคลีเอส เอนไซม์ไนไตรต์ และสารตกค้าง RNase ด้วยการปนเปื้อนของ DNA ของโฮสต์ที่ต่ำ ช่วยลดผลบวกปลอมในระบบได้อย่างมีประสิทธิภาพ YeasenRNase HII ทนความร้อนได้ดีมาก โดยยังคงใช้งานได้แม้จะผ่านไป 30 นาทีที่อุณหภูมิ 95°C จึงเข้ากันได้กับระบบปฏิกิริยา rhPCR ต่างๆ และยังเหมาะสำหรับ LAMP และการใช้งานอื่นๆ อีกด้วย

1. อี.โคไล เศษดีเอ็นเอจีโนม < 0.5 สำเนา/100 หน่วย

การตรวจจับของ อี.โคไล พบว่าสารตกค้างของ DNA จีโนมในชุดต่างๆ ของ RNase HII แสดงให้เห็นว่าสารตกค้างของ DNA จีโนมของโฮสต์ Yeasenค่า RNase HII ของ 's อยู่ต่ำกว่า 0.5 สำเนา/100 U มาก

รูปที่ 4 การตรวจจับ อี.โคไล เศษดีเอ็นเอจีโนม

2. การทดสอบความทนทานต่อความร้อน 95°C

หลังจากให้ความร้อน RNase HII ที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 0 ถึง 45 นาที ได้มีการทดสอบกิจกรรมเอนไซม์ของ RNase HII ผลการทดสอบระบุว่าแทบไม่มีการสูญเสียกิจกรรมเอนไซม์ใน YeasenRNase HII ยังคงสภาพดี แม้ผ่านการให้ความร้อนนานถึง 45 นาที

รูปที่ 5 การทดสอบความทนทานต่อความร้อน 95°C

3. ไม่มีสารตกค้างของเอ็กโซนิวคลีเอส เอ็นไซม์นิกกิ้ง หรือ RNase (โดส 1 ยู)

จากการฟัก RNase HII ในชุดต่างๆ จำนวน 1 หน่วยกับ DNA/RNA ซึ่งเป็นซับสเตรตตามลำดับที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง ผลการวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟรีซิสบนเจลอะกาโรสบ่งชี้ว่าไม่มีเอ็กโซนิวคลีเอส เอนไซม์นิกกิ้ง หรือสารตกค้าง RNase ใน RNase HII

รูปที่ 6.ผลการตรวจจับของเอ็กโซนิวคลีเอส เอ็นไซม์นิกกิ้ง และสารตกค้าง RNase

สินค้าที่เกี่ยวข้องที่แนะนำ

การประยุกต์ใช้ผลิตภัณฑ์	ชื่อสินค้า	หมายเลขแคตตาล็อก
rhPCR、โคมไฟ	อาร์นาสเอชไอไอ(2 ยู/ไมโครลิตร) RNase HII ปราศจากกลีเซอรอล (2 U/μL)	14539ES 14541ES
การตรวจ RhPCR	ไฮเอฟ® แทค ดีเอ็นเอ โพลิเมอเรส	10101ES
โคมไฟ RT	ไฮเอฟ® บีเอสที พลัส ดีเอ็นเอ โพลิเมอเรส (40 ยู/μL)	14402ES
	ฮิแฟร์® Ⅲ รีเวิร์สทรานสคริปเทส	11111ES

อ้างอิง

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบพึ่งพา RNase H (rhPCR): ความจำเพาะที่ปรับปรุงแล้วและการตรวจหาโพลีมอร์ฟิซึมของนิวคลีโอไทด์เดี่ยวโดยใช้ไพรเมอร์ที่แยกได้แบบบล็อก BMC Biotechnol. 2011 ส.ค. 10;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ และคณะ การตรวจจับการกลายพันธุ์ของนิวคลีโอไทด์เดี่ยวแบบขั้นตอนเดียวที่มีความจำเพาะสูงโดยการขยายสัญญาณแบบไอโซเทอร์มอลที่ควบคุมโดยไพรเมอร์ที่กระตุ้นด้วยลูป (PA-LAMP) [J] Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068