เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัดจาก Yeasen ซีรีส์ FuniCut™ ย่อยอาหารได้ภายใน 5 นาทีด้วยบัฟเฟอร์อเนกประสงค์
การโคลนโมเลกุลใช้กันในห้องปฏิบัติการเกือบทุกแห่ง เอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสเป็นส่วนประกอบสำคัญในการทดลองโคลนโมเลกุล แต่ผู้คนมักประสบปัญหาต่างๆ ที่เกิดขึ้นกับการทดลองเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสเช่นกัน ปัญหาทั่วไปมีดังนี้:
- มีเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสอยู่หลายประเภท จึงยากที่จะเลือก
- การแยกส่วนที่ผิดพลาด การแยกส่วนที่สุ่ม หรือการแยกแยะเอนไซม์ที่ไม่สมบูรณ์
- อัตราการย่อยอาหารจะช้า อาจต้องใช้เวลาถึงหนึ่งชั่วโมงหรือแม้แต่ข้ามคืนก็ได้
- นอกจากนี้ การทดลองการย่อยเอนไซม์หลายชนิดยังต้องเลือกการย่อยเอนไซม์หลายชนิดด้วย
เพื่อพิสูจน์ให้คุณเข้าใจเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสอย่างละเอียดถี่ถ้วนยิ่งขึ้น ต่อไปนี้จะอธิบายสั้นๆ ว่าเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสคืออะไร และเอ็นโดนิวคลีเอสต่างๆ ถูกจำแนกประเภทอย่างไรในการตอบคำถามแรก
1. Restriction Endonuclease คืออะไร?
2. ข้อจำกัดการตั้งชื่อเอ็นโดนิวคลีเอส
3. ข้อจำกัดในการจำแนกเอ็นโดนิวคลีเอส
4.
1. Restriction Endonuclease คืออะไร?
รีสตริกชันเอนโดนิวคลีเอสเป็นกลุ่มเอนไซม์ที่สามารถจดจำลำดับนิวคลีโอไทด์เฉพาะในโมเลกุลดีเอ็นเอสายคู่ และตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ในสายดีเอ็นเอที่ตำแหน่งเฉพาะ
เอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสที่แตกต่างกันจะจดจำลำดับดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน พวกมันสามารถตัดดีเอ็นเอภายในลำดับการจดจำหรือที่ตำแหน่งที่ไม่ไกลจากลำดับการจดจำ ส่งผลให้ได้ผลิตภัณฑ์ต่างๆ ดังแสดงในรูปที่ 1 BamHI จะสร้างปลายเหนียว KpnI จะสร้างปลาย 3'ticky และ EcoRV จะสร้างปลายทู่
รูปที่ 1 แผนผังการย่อยอาหารด้วย BamHI, KpnI, EcoRV
2. ข้อจำกัดการตั้งชื่อเอ็นโดนิวคลีเอส
ชื่อสกุล ชื่อสปีชีส์ สายพันธุ์หรือซีโรไทป์ของแบคทีเรีย และลำดับการค้นพบเป็นปัจจัยหลักที่ใช้ในการตั้งชื่อเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอส แนวทางการตั้งชื่อแสดงอยู่ในตารางที่ 1 ด้านล่าง โดยใช้ BstEII เป็นตัวอย่าง:
ตารางที่ 1 ข้อจำกัดการตั้งชื่อเอ็นโดนิวคลีเอส
| คำย่อ | ชื่อ-นามสกุล | นัยยะ |
| บี | เชื้อแบคทีเรีย | ตัวอักษรแรกของชื่อสกุล |
| เซนต์ | สเตียร์เทอร์โมฟิลัส | สองตัวอักษรแรกของชื่อสายพันธุ์ |
| อี | อีที | ตัวอักษรแรกของชื่อสายพันธุ์ |
| ครั้งที่สอง | การค้นพบครั้งที่สอง | การเรียงลำดับที่พบในแบคทีเรียดังกล่าว |
3.ข้อจำกัดในการจำแนกประเภทของเอ็นโดนิวคลีเอส
เอนไซม์ตัดจำเพาะสามารถแบ่งออกได้เป็น 4 ประเภท โดยพิจารณาจากความซับซ้อนของโครงสร้าง โหมดการทำงาน และความแตกต่างระหว่างโคแฟกเตอร์ ตารางที่ 2 ต่อไปนี้จะสรุปลักษณะเฉพาะและเอนไซม์ทั่วไปของแต่ละประเภท
ตารางที่ 2. ความแปรผันระหว่างเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสหลายชนิด
| คลาสเอ็นโดนิวคลีเอส | คุณสมบัติ | เอนไซม์ชนิดต่างๆ |
| ประเภทที่ 1 | 1. การจดจำและปรับเปลี่ยนการแยกตัว 2. สามารถจดจำลำดับ DNA ที่เฉพาะเจาะจงได้ และไซต์ย่อยจะอยู่ห่างจากไซต์จดจำอย่างไม่มีกำหนดเวลาได้มากถึงหลายพันเบส 3. การกระทำจำเป็นต้องใช้ ATP | EcoB, EcoK ฯลฯ |
| ประเภทที่ 2 | 1. มีเพียงฟังก์ชั่นการระบุการตัดเท่านั้น 2. ลำดับการจดจำมักจะเป็นลำดับพาลินโดรมสั้น (ประมาณ 4–8 bp) และตำแหน่งย่อยเฉพาะของเอนไซม์จำกัดเอนไซม์มักจะเป็นลำดับที่จดจำได้ 3. การกระทำจำเป็นต้องใช้ Mg2+ 4. ชนิดของเอนไซม์จำกัดชนิดที่นิยมใช้มากที่สุดในโคลนโมเลกุล | HindIII, NotI ฯลฯ |
| ประเภทที่ 3 | 1. การรู้จักและปรับเปลี่ยนการย่อย 2. เกี่ยวกับการแยกไซต์การจดจำออกจากไซต์การย่อย 3. การกระทำจำเป็นต้องใช้ ATP | HinfIII และคณะ |
| ประเภทที่ 4 | 1. ตัดเฉพาะลำดับ DNA ที่ถูกเมทิลเลชั่นเท่านั้น 2. ประมาณ 30 bp จะแยกไซต์การจดจำออกจากไซต์การย่อย | McrA, McrBC ฯลฯ |
ดังที่ระบุไว้ในตารางที่ 3 ด้านล่าง สามารถแบ่งออกได้เป็น 3 กลุ่มตามความคล้ายคลึงและความแตกต่างระหว่างตำแหน่งการจดจำและการย่อยอาหาร
ตารางที่ 3.การวิเคราะห์เชิงเปรียบเทียบของ Isoschizomer, Neoschizomer และ Isocaudarner
|
| ไอโซไซโซเมอร์ | นีโอไซโซเมอร์ | อิโซเคาดาร์เนอร์ |
| ลำดับการจดจำ | เดียวกัน | เดียวกัน | แตกต่าง |
| สถานที่ย่อยอาหาร | เดียวกัน | แตกต่าง | เดียวกัน |
| ตัวแทนทั่วไป | AgeI และ BshTI: ทั้งสองรับรู้และแยก 5′-A↓CCGGT-3′ | สมาย (5′-CCC↓GGG-3′) และ XmaI(5′-C↓CCGGG-3′) | BamHI (5'-G↓GATCC-3') และ BglII (5'-A↓GATCT-3') |
เมื่อพิจารณาจากข้อเท็จจริงที่ว่าเอนไซม์จำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสบางชนิดในตลาดยังคงต้องย่อยข้ามคืน และผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีแนวโน้มที่จะย่อยไม่ถูกต้อง
4. Yeasen ฟันนี่คัท™ เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัดความเร็ว
รูปที่ 2.
4.1 คุณสมบัติ
- การย่อยอย่างรวดเร็ว: การย่อยสามารถเสร็จสิ้นภายใน 5–15 นาที ซึ่งสามารถลดเวลาลงได้กว่า 1–2 ชั่วโมงเมื่อเปรียบเทียบกับการทดลองย่อยอาหารแบบเดิม
- บัฟเฟอร์สากล: ปฏิกิริยาการแยกเอนไซม์หลายชนิดทำได้ง่ายขึ้นเนื่องจากเอนโดนิวคลีเอสรวมกันใดๆ ก็สามารถใช้บัฟเฟอร์ตัวเดียวกันได้
- ผลของการย่อยเอนไซม์: เทียบเท่ากับ N* และเหมาะสมกับบัฟเฟอร์ของมัน
- การวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้าโดยตรงทำให้กระบวนการง่ายขึ้นโดยให้บัฟเฟอร์สีแดงและช่วยให้สามารถนำผลิตภัณฑ์จากการย่อยไปทำการวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้าโดยตรง
- การย่อยที่แม่นยำ: แม้จะย่อยข้ามคืน แต่ก็มีกิจกรรมดาวน้อยมาก
4.2 การจัดนิทรรศการผลงาน
4.2.1 ในบัฟเฟอร์ FuniCut™ การย่อยแบบเดี่ยว แบบคู่ และแบบสามจะเกิดขึ้นใน 5 นาที
รูปที่ 3 การย่อยแบบเดี่ยว แบบคู่ และแบบสามโดยใช้ FuniCut™ โดยทั่วไปบัฟเฟอร์สามารถเสร็จสิ้นได้ภายใน 5 นาที เช่น การย่อยสามชั้นโดยใช้ EcoRI+KpnI+SmaI
4.2.2 ผลกระทบของการย่อยด้วยเอนไซม์นั้นเทียบได้กับผลกระทบของ N* และ T* และทำงานได้ดีกับบัฟเฟอร์ของพวกมัน
รูปที่ 4 เมื่อเปรียบเทียบกับสินค้า N*, T* ที่คล้ายกัน
4.2.3 การย่อยอาหารข้ามคืนโดยมีกิจกรรมดาวต่ำมาก
รูปที่ 5 ใช้เอนไซม์เอ็นโดนิวคลีเอสชนิดเร็ว HindIII, NheI, PstI, XbaI และ XhoI จาก
4.2.4 มีความซ้ำซ้อนสูงและสามารถจัดการกับสารตั้งต้นส่วนเกินบางส่วนได้
รูปที่ 6 การใช้ FuniCut™ Fast Restriction Endonucleases EcoR I, Eag I, XbaI และ Sac I โดยใช้พลาสมิด 1 μg และ 1.5 μg เป็นสารตั้งต้นตามลำดับ แล้วย่อยเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นผลิตภัณฑ์ที่ย่อยแล้วจะถูกนำไปทำการวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเจลอะกาโรส
ตารางที่ 4.ผลิตภัณฑ์และความเข้ากันได้ของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา
| ชื่อสินค้า | แมว# | ลำดับการจดจำ | อุณหภูมิ | อุณหภูมิปิดการใช้งานความร้อน |
| ที*บัฟเฟอร์ | เอ็น*บัฟเฟอร์ | ตะ*บัฟเฟอร์ | ฐานป้องกัน (bp) | การตอบกลับ |
| ฟันนิคัท™ แอสซีไอ (สอบถาม- | 15001ES50 | จีจี/ซีจีซีซีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| ฟันนิคัท™ AvrII (สอบถาม- | 15002ES25 | ซี/ซีแทก | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25ตัน |
| ฟันนิคัท™ แบมเอชไอ (สอบถาม- | 15003ES76 | จี/จีเอทีซีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ BclI (สอบถาม- | 15004ES62 | ที/กัตก้า | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 125T |
| ฟันนิคัท™ บีเอสเอไอ (สอบถาม- | 15005ES50 | จีจีทีซีทีซี(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | ไม่ | 50T |
| ฟันนิคัท™ BstEII (สอบถาม- | 15006ES60 | จี/จีทีเอ็นเอซีซี | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | ไม่ | 100ตัน |
| FuniCut™ แคลอิ (สอบถาม- | 15007ES50 | เอที/ซีจีเอที | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| ฟันนิคัท™ DpnII (สอบถาม- | 15008ES50 | /กทช. | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | ไม่ | 50T |
| ฟันนิคัท™ อีเอจีไอ (สอบถาม- | 15009ES25 | ซี/จีจีซีจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25ตัน |
| ฟันนิคัท™ อีโคอาร์ไอ (สอบถาม- | 15010ES78 | จี/เอเอทีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 600ตัน |
| ฟันนิคัท™ อีโคอาร์วี (สอบถาม- | 15011ES70 | แกท/เอทีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ ฮินด III (สอบถาม- | 15012ES76 | เอ/เอจีซีทีที | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ เอชพีเอไอ (สอบถาม- | 15013ES50 | จีทีที/เอเอซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 1 | 50T |
| ฟันนิคัท™ KpnI (สอบถาม- | 15015ES70 | จีจีทีเอซี/ซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ มลูอิ (สอบถาม- | 15016ES60 | ก/ก จี ซี จี ที | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 100ตัน |
| ฟันนิคัท™ NcoI (สอบถาม- | 15018ES30 | ซี/แคทจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30ตัน |
| ฟันนิคัท™ NdeI (สอบถาม- | 15019ES70 | แคลิฟอร์เนีย/ทาทจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ เอ็นเฮอิ (สอบถาม- | 15020ES30 | จี/ซีทีเอซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30ตัน |
| FuniCut™ ไม่ใช่ฉัน (สอบถาม- | 15021ES50 | จีซี/จีจีซีซีจีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| ฟันนิคัท™ PstI (สอบถาม- | 15022ES76 | ซีทีจีเอ/จี | 37 | เลขที่ | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ แซคไอ (สอบถาม- | 15023ES60 | GAGCT/ซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 100ตัน |
| ฟันนิคัท™ ซาลอิ (สอบถาม- | 15024ES70 | จี/ทีซีจีเอซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ SbfI (สอบถาม- | 15025ES25 | ซีซีทีจีเอ/จีจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25ตัน |
| ฟันนิคัท™ ขนาดเล็ก (สอบถาม- | 15027ES60 | ซีซีซี/จีจีจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100ตัน |
| เกม FuniCut™ (สอบถาม- | 15028ES50 | ก/กท | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| ฟันนิคัท™ SphI (สอบถาม- | 15029ES50 | ก.ก.ท./ก. | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| ฟันนิคัท™ SspI (สอบถาม- | 15030ES56 | เอเอที/เอทีที | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 60ตัน |
| สตู FuniCut™ (สอบถาม- | 15031ES60 | เอจีจี/ซีซีที | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100ตัน |
| ฟันนิคัท™ แทคไอ (สอบถาม- | 15032ES70 | ที/ซีจีเอ | 65 | เลขที่ | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ เอ็กซ์บีเอ (สอบถาม- | 15033ES76 | ต/ค | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ XhoI (สอบถาม- | 15034ES76 | ซี/ทีซีจีเอจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ FspI (สอบถาม- | 15036ES50 | ทีจีซี/จีซีเอ | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 50T |
| บานพับ FuniCut™ (สอบถาม- | 15038ES76 | จี/แอนทีซี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 500ตัน |
| ฟันนิคัท™ อะพาลิ (สอบถาม- | 15039ES70 | จี/ทีจีซีเอซี | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 4 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ นูรอิ (สอบถาม- | 15040ES50 | ทีซีจี/ซีจีเอ | 37 | เลขที่ | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 50T |
| จุก FuniCut™ (สอบถาม- | 15041ES25 | สมาคมส่งเสริมสุขภาพไทย/สมาคมส่งเสริมสุขภาพไทย | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25ตัน |
| ฟันนิคัท™ PvuII (สอบถาม- | 15042ES70 | ซีเอจี/ซีทีจี | 37 | เลขที่ | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200ตัน |
| ฟันนิคัท™ แซค II (สอบถาม- | 15043ES50 | ซีซีจีซี/จีจี | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| ฟันนิคัท™ NsiI (สอบถาม- | 15044ES25 | เอทีจีเอ/ที | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25ตัน |
| ฟันนิคัท™ Esp3I (BsmBI) (สอบถาม- | 15048ES30 | CGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 30ตัน |
| ฟันนิคัท™ BglII (สอบถาม- | 15049ES60 | ก/กทปส | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 100ตัน |
| ฟันนิคัท™ BstBI (สอบถาม- | 15050ES60 | ทีที/ซีจีเอเอ | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | ไม่ | 100ตัน |
| ฟันนิคัท™ MnlI (สอบถาม- | 15051ES50 | ซีซีทีซี(7/6) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
CpG: ได้รับผลกระทบจากการเมทิลเลชันของ CpG
EK: ได้รับผลกระทบจากเมทิลเลชันของ EcoKI
EB: ได้รับผลกระทบจากการเมทิลเลชันของ EcoBI
Dcm: ได้รับผลกระทบจากการเมทิลเลชันของ Dcm
เขื่อน : ได้รับผลกระทบจากเมทิลเลชันของเขื่อน