- พื้นหลัง
ข้อมูลสรุปในรายงานนี้ดำเนินการโดย
ข้อมูลสรุปมีไว้สำหรับผู้ใช้อ้างอิงเท่านั้น และผู้ใช้จำเป็นต้องตรวจสอบวิธีการตรวจไมโคพลาสมาโดยใช้ตัวอย่างของตนเองเพื่อยืนยันว่าวิธีการดังกล่าวสามารถตอบสนองความต้องการของผู้ใช้ได้ ขอแนะนำให้ห้องปฏิบัติการทั้งหมดที่ใช้ชุดตรวจนี้ตรวจสอบพารามิเตอร์ต่อไปนี้: ขีดจำกัดการตรวจจับ ความจำเพาะ และความแข็งแกร่ง
เนื้อหาการตรวจสอบ：
| ผลงาน | พารามิเตอร์การตรวจสอบ | ผลการตรวจสอบ |
| ขีดจำกัดการตรวจจับ | ขีดจำกัดการตรวจจับสายพันธุ์ไมโคพลาสมา | ขีดจำกัดในการตรวจจับไมโคพลาสมาเภสัชเภสัช 10 ชนิด: 10 CFU/mL โดยแต่ละชนิดทดสอบ 24 ครั้ง ด้วยอัตราการตรวจจับ ≥95% |
| ความเฉพาะเจาะจง | ตัวอย่างการรบกวนของเมทริกซ์ | ทดสอบเมทริกซ์ตัวอย่าง 9 แบบที่แตกต่างกันและสารละลายเจือจาง DNA ไม่ตรวจพบไมโคพลาสมา |
| ปฏิกิริยาข้าม | ทดสอบ 14 สายพันธุ์และเซลล์วิศวกรรม 6 เซลล์ที่ใช้กันทั่วไปในผลิตภัณฑ์ชีวเภสัช ไม่ตรวจพบไมโคพลาสมา | |
| ความทนทาน | เสถียรภาพของการแช่แข็งและการละลาย | สามารถทนต่อการแช่แข็ง-ละลายซ้ำได้ 20 รอบโดยไม่ส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพการทำงานของชุดอุปกรณ์ |
| เสถียรภาพการเร่งความร้อน | ไม่ได้รับผลกระทบภายใต้สภาวะอุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 14 วัน และ 4°C เป็นเวลา 30 วัน | |
| ความเข้ากันได้ของเครื่องมือ | เข้ากันได้กับ ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 และ Roche LightCycler®480 | |
| ความครอบคลุม | ความครอบคลุมของชนิด DNA ของไมโคพลาสมา | การเปรียบเทียบฐานข้อมูลโดยใช้ลำดับ 16S rRNA ของไมโคพลาสมาครอบคลุม 183 สปีชีส์ภายในคลาส Mollicutes |
- วัสดุและวิธีการทดลอง
2.1 มายค์อะเวย์ทีเอ็ม ชุดตรวจหา Mycoplasma แบบเรียลไทม์ qPCR (2G) ผู้จำหน่าย:
2.2 โมลเพียวทีเอ็ม ชุดเตรียมตัวอย่าง DNA ตกค้างแม่เหล็ก ผู้ขาย:
2.3 มาตรฐานความไวต่อไมโคพลาสมาซื้อจาก Minerva Biolabs (MB) ซึ่งสายพันธุ์มาจาก National Collection of Type Cultures (NCTC) มาตรฐานความไวคือไมโคพลาสมาที่ทำให้ไม่ทำงานและใช้สำหรับการตรวจสอบวิธีการขยายกรดนิวคลีอิก (วิธี qPCR/PCR) เพื่อการตรวจจับไมโคพลาสมา มีการซื้อไมโคพลาสมาทั้งหมด 10 ชนิด ซึ่งรวมถึงข้อกำหนดของ EP 2.6.7 และ JP G3 ข้อมูลเกี่ยวกับมาตรฐานมีดังนี้:
| ผู้ขาย | หมายเลขแมว | เลขที่ NCTC | เอทีซีซี เลขที่ | ชื่อวัสดุ |
| ห้องปฏิบัติการมิเนอร์วา ไบโอแล็บส์ (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา อาร์จินี |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมาช่องปาก | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา กัลลิเซพติคัม | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา ปอดบวม | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมาซิโนเวีย | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา เฟอร์เมนแทน | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา ไฮโอรินิส | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว อะโคลพลาสมา ไลด์ลาวี | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10 ซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว สไปโรพลาสมาซิทรี | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10หน่วยซีเอฟยู™ มาตรฐานความไว ไมโคพลาสมา ซาลิวาเรียม |
2.4 ข้อมูลต้นฉบับ: บันทึกเวอร์ชันอิเล็กทรอนิกส์ไว้ใน 'รายงานการทดลอง' ไฟล์ย่อยของไฟล์หลัก 'MycAwayทีเอ็ม ชุดตรวจหาเชื้อไมโคพลาสมาแบบเรียลไทม์ qPCR (2G)'
2.5 วิธีการ: วัสดุและวิธีการดำเนินการที่ใช้ในการทดลองนั้นผลิตหรือกำหนดขึ้นโดยพื้นฐานแล้ว
- เนื้อหาและผลลัพธ์ของคุณสมบัติ
3.1 ขีดจำกัดการตรวจจับ (LOD)
การสกัดกรดนิวคลีอิกและการตรวจหาเชื้อไมโคพลาสมามาตรฐาน 10 CFU/mL ดำเนินการตามคำแนะนำสำหรับเชื้อไมโคพลาสมามาตรฐานและคำแนะนำสำหรับชุดสกัดและตรวจหาเชื้อ ได้ผลการทดสอบทั้งหมด 24 รายการสำหรับเชื้อไมโคพลาสมามาตรฐาน 10 CFU/mL ตัวอย่าง NCS (ตัวอย่างควบคุมเชิงลบ) และ NTC (ตัวอย่างควบคุมที่ไม่มีเทมเพลต) ได้รับการทดสอบพร้อมกันในแต่ละการทดลอง
ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าผล NCS และ NTC เป็นที่น่าพอใจ โดยตัวอย่างทั้ง 24 10 CFU/mL มีผลทดสอบเป็นบวก ซึ่งตรงตามข้อกำหนดที่ต้องมีผลทดสอบเป็นบวกอย่างน้อย 23 รายการจากการทดสอบทั้งหมด 24 รายการ
| เลขที่ | ชื่อวัสดุ | ความเข้มข้นของของเหลวแบคทีเรีย |
| 1 | ไมโคพลาสมา อาร์จินี | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 2 | ไมโคพลาสมาช่องปาก | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 3 | ไมโคพลาสมา กัลลิเซพติคัม | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 4 | ไมโคพลาสมา ปอดบวม | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 5 | ไมโคพลาสมาซิโนเวีย | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 6 | ไมโคพลาสมา เฟอร์เมนแทน | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 7 | ไมโคพลาสมา ไฮโอรินิส | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 8 | อะโคเลพลาสมา ลาดิลาวี | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 9 | สไปโรพลาสมาซิทรี | 10 ซีเอฟยู/มล. |
| 10 | ไมโคพลาสมา ซาลิวาเรียม | 10 ซีเอฟยู/มล. |
ตารางที่ 1 ข้อมูลเกี่ยวกับสายพันธุ์ที่ผ่านการตรวจสอบ
| 10 ซีเอฟยู/มล. | การทดลองที่ 1 | การทดลองที่ 2 | การทดลองที่ 3 |
| อัตราการตรวจจับ | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| ทั้งหมด | 24/24 | ||
ตารางที่ 2 ผลขีดจำกัดการตรวจจับ
3.2 ความเฉพาะเจาะจง
3.2-1 ระยะทดสอบไมโคพลาสมา
ลำดับไพรเมอร์โพรบในชุดได้รับการเปรียบเทียบกับจีโนม 16S rRNA ในฐานข้อมูล จากการวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ พบว่า MycAwayทีเอ็ม ชุดตรวจหาเชื้อ Mycoplasma qPCR (วิธี Probe) ของ NextSense Biologicals สามารถครอบคลุมเชื้อ Zooxanthellae ได้อย่างน้อย 183 สายพันธุ์ รวมถึง Mycoplasma 120 สายพันธุ์ Ureaplasma 9 สายพันธุ์ Spiroplasma 33 สายพันธุ์ และ Cholestrongyla 7 สายพันธุ์ และอื่นๆ
3.2-2 ตัวอย่างการรบกวนของเมทริกซ์
สารตั้งต้น 9 ชนิด (Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Ham's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Ham's F-12K Kaighn's+1.0mM/L Glutamine, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2(05 mM L-Glutamine, DMEM-low Sugar Standard Medium) ใช้เป็นตัวอย่างเพื่อตรวจสอบการรบกวนของเมทริกซ์ตัวอย่าง โดยผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าตัวกลางนี้ไม่มีการรบกวนต่อรีเอเจนต์ของชุดทดสอบ
3.2-3 ระยะการตรวจจับเฟล็กซิแบคทีเรีย
การสกัดและตรวจหาไมโคพลาสมาที่ตายแล้ว (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) ที่ 10 CFU/mL เป็นสิ่งจำเป็น ร่วมกับการทดสอบตัวอย่าง NCS และ NTC
ผลการตรวจพบว่าไม่ตรวจพบ NCS และ NTC และให้ผลเป็นลบ ตรวจพบไมโคพลาสมาทั้ง 10 ชนิด และให้ผลเป็นบวก
3.2-4 ปฏิกิริยาครอส
สำหรับสายพันธุ์ที่ไม่ใช่ flexibacter 14 สายพันธุ์ ได้แก่ Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), จุลินทรีย์ Bacillus-coccus-fungi ทั่วไปอื่นๆ อีกจำนวนหนึ่ง (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis และ Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) และเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรม 6 เซลล์ (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) ใช้ในการตรวจหาไมโคพลาสมาโดยใช้ MolPureทีเอ็ม ชุดเตรียมการประมวลผลตัวอย่าง DNA ที่เหลือด้วย Magnetic Bead Method (ขวด) และ MycAwayทีเอ็ม ชุดตรวจหาไมโคพลาสมา qPCR (วิธีการตรวจ) (2G) และการทดลองแต่ละครั้งดำเนินการพร้อมกันด้วยการทดสอบตัวอย่าง PCS, NCS และ NTC
ผลการทดสอบพบว่า PCS, NCS และ NTC มีค่าเป็นที่น่าพอใจ โดยตัวอย่างทดสอบเป็นลบ และไม่มีปฏิกิริยาไขว้เกิดขึ้น
3.3 ความแข็งแกร่ง
3.3.1 ความเสถียรของการแช่แข็งและละลาย
ชุดทดสอบไมโคพลาสมาได้รับการทดลองการแช่แข็งและละลายภายใต้เงื่อนไข -25℃~-15℃ และผลแสดงให้เห็นว่าชุดทดสอบสามารถทนต่อการแช่แข็งและละลายซ้ำได้ถึง 20 ครั้ง และไม่มีผลกระทบกับประสิทธิภาพ
3.3-2 เสถียรภาพที่เร่งขึ้น
ชุดตรวจหาไมโคพลาสมาได้รับการเร่งความร้อนที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 14 วัน และที่ 4℃ เป็นเวลา 30 วัน ตามลำดับ และผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์ไม่ได้รับผลกระทบ
3.3-3 ความสามารถในการใช้เครื่องมือ
สำหรับชุดตรวจหาไมโคพลาสมา ได้ใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารควบคุมเชิงบวกและดีเอ็นเอของ Mycoplasma pneumoniae ในชุดเป็นตัวอย่างที่จะทดสอบ และการทดลองได้ดำเนินการกับแบรนด์และรุ่นที่แตกต่างกันสี่แบรนด์ คือ Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S และ Roche LightCycler®480 ตามลำดับการทดลองดำเนินการบนเครื่องมือ qPCR ของ 4 ยี่ห้อและรุ่นที่แตกต่างกัน ได้แก่ Shanghai Hongshi SLAN-96S และ Roche LightCycler®480
ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างที่ต้องทดสอบได้รับการตรวจพบบนเครื่องมือ qPCR ของรุ่นต่างๆ ของผู้ผลิต และผลการควบคุมเชิงลบได้รับการรับรอง และประสิทธิภาพของชุดทดสอบไม่ได้รับผลกระทบ
- 4-อ้างอิง
4.1 วิธีการตรวจไมโคพลาสมา <3301>. ตำรายาจีน ส่วนที่ III [S]. ปักกิ่ง: สำนักพิมพ์วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศจีน 2020: 542-543.
4.2 แนวทางการตรวจสอบวิธีการวิเคราะห์ <9101>. ตำรายาจีน ส่วนที่ III [S]. ปักกิ่ง: สำนักพิมพ์วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศจีน 2020: 682
4.3 แนวทางการตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการทางเลือกสำหรับการทดสอบจุลชีววิทยาของยา <9201>. ตำรายาจีน ส่วนที่ III [S]. ปักกิ่ง: สำนักพิมพ์วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศจีน 2020: 684
4.4 ไมโคพลาสมา ตำรายาแห่งยุโรป[S] ฉบับที่ 10, 2020: ส่วนที่ 2.6.7, 194-199
4.5 การทดสอบไมโคพลาสมาสำหรับพื้นผิวเซลล์ที่ใช้ในการผลิตผลิตภัณฑ์ทางชีวเทคโนโลยี/ชีวภาพ <G3-14-170> ตำรายาญี่ปุ่น[S] ฉบับที่ 18, 2021: 2678-2682
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham และคณะ ผลกระทบต่อคุณลักษณะคุณภาพผลิตภัณฑ์ของแอนติบอดีโมโนโคลนัลที่ผลิตขึ้นในวัฒนธรรมไบโอรีแอ็กเตอร์เซลล์ CHO ในระหว่างเหตุการณ์ปนเปื้อนไมโคพลาสมาโดยตั้งใจ เทคโนโลยีชีวภาพและวิศวกรรมชีวภาพ 2020;117(9): 2802-2815
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov การทดสอบไมโคพลาสมาของสารตั้งต้นของเซลล์และสารชีวภาพ: การทบทวนเทคนิคทางเลือกที่ไม่ใช่ทางจุลชีววิทยา Mol Cell Probes 2554 เม.ย.-มิ.ย.;25(2-3):69-77
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas วิธีการตรวจจับ PCR สำหรับการทดสอบการปนเปื้อนไมโคพลาสมาของวัคซีนสำหรับสัตว์และผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ Lett in Applied Microbiology กุมภาพันธ์ 2015;60(2):174-180
ข้อมูลการสั่งซื้อ
| คำอธิบาย | หมายเลขชิ้นส่วน |
| 18461ES | |
| ชุดตรวจหา Mycoplasma qPCR MycAway™ (2จี) | 40619ES |