เทคโนโลยีการขยายแบบอุณหภูมิคงที่สามารถบรรลุวัตถุประสงค์ในการขยายลำดับกรดนิวคลีอิกเฉพาะภายใต้สภาวะอุณหภูมิคงที่ เนื่องจากไม่มีอุปกรณ์พิเศษ เวลาในการขยายสั้น และความไวสูง จึงมีแนวโน้มการใช้งานที่ดีในการตรวจจับในสถานที่และการวินิจฉัยที่จุดดูแลผู้ป่วย และเหมาะมากสำหรับการพัฒนาเครื่องมือวินิจฉัยระดับโมเลกุล

ในบริบทของการระบาดของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่มีสายพันธุ์และการติดเชื้อเพิ่มขึ้น เทคโนโลยีการขยายสัญญาณแบบไอโซเทอร์มอลสามารถตรวจจับไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ได้ อย่างรวดเร็วด้วยเครื่องมือที่เรียบง่าย ช่วยแก้ปัญหาที่ไม่สามารถยืนยันผู้ป่วย COVID-19 บางรายได้อย่างรวดเร็วเนื่องจากเวลาในการตรวจจับที่ยาวนานและมีความต้องการอุปกรณ์ตรวจจับและสารเคมีสูงในเทคนิค PCR แบบดั้งเดิม แล้วหลักการของ RT-LAMP ซึ่งเป็นเทคนิคการขยายสัญญาณแบบอุณหภูมิคงที่หนึ่งมีอะไรบ้าง วัตถุดิบคุณภาพสูงที่นำมาใช้คืออะไร Yeasen สามารถให้บริการได้ไหม?

1. หลักการของ RT-LAMP คืออะไร?
2. การออกแบบไพรเมอร์สำหรับ RT-LAMP
3.วัตถุดิบอะไรบ้างที่สามารถ Yeasen จัดเตรียม?
4. คำแนะนำการเลือกผลิตภัณฑ์

1. หลักการของ RT-LAMP คืออะไร?

ในปี 2000 นักวิชาการชาวญี่ปุ่น Notomi และคนอื่นๆ ได้ก่อตั้งเทคโนโลยีการขยายกรดนิวคลีอิกใหม่ที่เรียกว่าการขยายไอโซเทอร์มอลแบบลูปมีเดียเต็ด (LAMP) LAMP ใช้ไพรเมอร์เฉพาะ 4 ตัวที่ออกแบบมาสำหรับ 6 ส่วนของยีนเป้าหมาย และใช้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบแทนที่สายเพื่อขยายสำเนาของลำดับเป้าหมาย 109 ชุดในเวลาสิบนาทีภายใต้สภาวะไอโซเทอร์มอล (60～65 ℃) ผลลัพธ์ได้รับการตัดสินโดยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส และผลลัพธ์เชิงบวกแสดงให้เห็นแถบรูปบันได LAMP มีลักษณะเฉพาะของความจำเพาะที่แข็งแกร่ง ความไวสูง การทำงานที่รวดเร็วและง่ายดาย และต้นทุนต่ำ ด้วยการพัฒนาอย่างต่อเนื่องและความสมบูรณ์แบบของเทคโนโลยีนี้ ปัจจุบันจึงใช้ในการตรวจจับจุลินทรีย์ก่อโรคต่างๆ

RT-LAMP เป็นวิธีการที่เพิ่มเอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับเข้าไปในระบบขยาย LAMP ซึ่งสามารถตรวจจับ RNA ของไวรัสได้โดยตรง ประสิทธิภาพการขยายของ LAMP นั้นสูงมาก จึงสามารถขยายกรดนิวคลีอิกได้ในปริมาณมากด้วย cDNA ในปริมาณเพียงเล็กน้อย ช่วยประหยัดเวลาในการถอดรหัสย้อนกลับในกระบวนการขยายกรดนิวคลีอิก และความเร็วในการตรวจจับ RNA ก็เพิ่มขึ้นด้วย

DNA อยู่ในสภาวะสมดุลแบบไดนามิกที่ประมาณ 65℃ ภายใต้การกระทำของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบแทนที่สาย โดยเริ่มจากปลาย 3' ของส่วน F2 ของไพรเมอร์ FIP ดีเอ็นเอจะจับคู่กับลำดับที่เติมเต็มของดีเอ็นเอแม่แบบเพื่อเริ่มต้นการสังเคราะห์ดีเอ็นเอแบบแทนที่สาย ไพรเมอร์ F3 เป็นส่วนเติมเต็มของ F3c ที่ปลายด้านหน้าของ F2c และใช้ปลาย 3' เป็นจุดเริ่มต้นในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในขณะที่แทนที่สายดีเอ็นเอที่สังเคราะห์โดยไพรเมอร์ FIP ชั้นนำด้วยการกระทำของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบแทนที่สาย ยืดไปข้างหน้า สายดีเอ็นเอที่สังเคราะห์โดยไพรเมอร์ F3 สุดท้ายจะสร้างสายคู่ที่มีสายดีเอ็นเอแม่แบบหนึ่งสาย สายดีเอ็นเอที่สังเคราะห์โดยไพรเมอร์ FIP จะถูกแทนที่ด้วยสายไพรเมอร์ F3 เพื่อสร้างสายเดี่ยว สายเดี่ยวนี้มีส่วน F1c และ F1 ที่เติมเต็มกันที่ปลาย 5' ดังนั้นจึงทำการจับคู่เบสตัวเองเพื่อสร้างโครงสร้างแบบวงกลม และไพรเมอร์ BIP จะถูกไฮบริดและรวมกับสายเดี่ยว และปลาย 3' ของไพรเมอร์ BIP จะถูกใช้เป็นจุดเริ่มต้นในการสังเคราะห์สายเสริม และโครงสร้างจะถูกเปิดในกระบวนการจากนั้นไพรเมอร์ที่คล้ายกับ F3 และ B3 จะถูกแทรกจากไพรเมอร์ BIP การจับคู่เบสที่เสริมกันจะเกิดขึ้น และสายที่เสริมกันใหม่จะถูกสังเคราะห์จากปลาย 3' เป็นจุดเริ่มต้น มีลำดับที่เสริมกันที่ปลายทั้งสองข้างของดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ถูกแทนที่ และการจับคู่เบสเองจะเกิดขึ้นเพื่อสร้างโครงสร้างวงกลม ดังนั้นสายทั้งหมดจึงมีโครงสร้างคล้ายดัมเบลล์ โครงสร้างนี้เป็นโครงสร้างเริ่มต้นของวงจรการขยายของวิธี RT-LAMP

โครงสร้างรูปดัมเบลล์จะขยาย DNA โดยใช้ส่วน F1 ที่ปลาย 3' เป็นจุดเริ่มต้นและใช้ตัวเองเป็นแม่แบบ ไพรเมอร์ FIP F2 จะไฮบริดไดซ์กับ F2c สายเดี่ยวบนลูปเพื่อเริ่มปฏิกิริยาการแทนที่สายรอบใหม่ กรดนิวคลีอิกสายคู่ที่สังเคราะห์จากส่วน F1 จะแยกตัวออกจากกัน และในทำนองเดียวกัน โครงสร้างวงกลมจะถูกสร้างขึ้นบนกรดนิวคลีอิก มีรูปแบบสายเดี่ยวของ B2c บนโครงสร้างวงกลม และ B2 บนไพรเมอร์ BIP จะไฮบริดไดซ์กับ B2c เพื่อเริ่มการขยายรอบใหม่ และโครงสร้างวงกลมจะถูกสร้างขึ้นผ่านกระบวนการเดียวกัน ตามกระบวนการนี้ ลำดับที่เสริมกันบนสายเดียวกันจะหมุนเวียนผ่านการจับคู่ ขยายสาย และสุดท้ายสร้างโครงสร้างที่มีขนาดต่างกัน

2. การออกแบบไพรเมอร์สำหรับ RT-LAMP

การออกแบบไพรเมอร์เป็นกุญแจสำคัญในการขยายและตรวจจับ RT-LAMP ให้ประสบความสำเร็จ ไพรเมอร์ RT-LAMP ประกอบด้วยไพรเมอร์ภายนอกสองตัว (F3 และ B3) และไพรเมอร์ภายในสองตัว (FIP และ BIP) ไพรเมอร์ F3: ไพรเมอร์ภายนอกต้นน้ำ ซึ่งประกอบด้วยภูมิภาค F3 เป็นส่วนเสริมของภูมิภาค F3c ของยีนเป้าหมาย ไพรเมอร์ FIP: ไพรเมอร์ภายในต้นน้ำ ซึ่งประกอบด้วยภูมิภาค F2 ภูมิภาค F2c ที่ปลาย 3' ของยีนเป้าหมายในภูมิภาค F2 เป็นส่วนเสริมของภูมิภาค F1c ที่ปลาย 5' ของยีนเป้าหมาย ไพรเมอร์ BIP: ไพรเมอร์ภายในปลายน้ำ ซึ่งประกอบด้วยภูมิภาค B2 ภูมิภาค B2 เป็นส่วนเสริมของภูมิภาค B2c ที่ปลาย 3' ของยีนเป้าหมาย และมีลำดับเดียวกันกับภูมิภาค B1c ที่ปลาย 5' ของยีนเป้าหมาย

หลักการของการออกแบบไพรเมอร์ควรคำนึงถึงปัจจัยต่างๆ เช่น องค์ประกอบของเบส ปริมาณ GC และโครงสร้างย่อย เช่นเดียวกับ PCR นอกจากนี้ ควรสังเกตจุดต่อไปนี้ด้วย ส่วนปลาย 5' ของไพรเมอร์ด้านใน FIP และ BIP เช่น F1c และ B1c มีความยาวโดยทั่วไป 8-50 bp ความยาวโดยทั่วไปคือ 15-25 bp และค่า Tm จะมากกว่าค่า Tm ของ F2 และ B2 ที่ส่วนปลาย 3' ส่วนปลาย 3' ของไพรเมอร์ด้านใน FIP และ BIP เช่น F2 และ B2 มีความยาวโดยทั่วไปคือ 8-50 bp ความยาวโดยทั่วไปคือ 15-25 bp และค่า Tm จะสอดคล้องกับอุณหภูมิที่เหมาะสมของ Bst DNA polymerase ที่เลือกในการทดลอง ความยาวของไพรเมอร์ด้านนอก F3 และ B3 โดยทั่วไปคือ 8-50 bp ควรมีความยาว 15-25 bp และค่า Tm จะต้องน้อยกว่าของ F2 และ B2 เมื่อออกแบบไพรเมอร์ ควรพิจารณาโครงสร้างลูปและขนาดของลำดับเป้าหมาย เมื่อจำนวนเบสในลูปมากกว่า 40 bp และขนาดของลำดับเป้าหมายคือ 130-200 bp ประสิทธิภาพการขยายจะสูงที่สุด

3.วัตถุดิบอะไรบ้างที่สามารถ Yeasen จัดเตรียม?

3.1 [อัพเกรดใหม่] Yeasen บีเอสที พลัสดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

การอัพเกรดใหม่ล่าสุด ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Hieff™ Bst Plus (รหัสสินค้า 14402ES, 14403ES) ได้มาจากการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ยีน DNA โพลิเมอเรสของเชื้อ Bacillus stearothermophilus สป ขาดโดเมนเอ็กโซนิวคลีเอส 5′→3′ ใน E.coliความสามารถในการเคลื่อนย้ายสายเอนไซม์มีความแข็งแกร่ง และมีข้อดีคือมีความไวสูง ประสิทธิภาพในการขยายสูง และทนต่อ dUTP สูง และสามารถใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจจับเชื้อโรคแบบเรียลไทม์โดยอาศัยเทคโนโลยีการขยายแบบไอโซเทอร์มอล

3.1.1 รวดเร็วและมีความไวสูง

Yeasen ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Hieff™ Bst Plus มีความไวสูงและตรวจจับยีนเป้าหมายได้น้อยถึง 5 สำเนา ปริมาณเทมเพลตอยู่ที่ระดับเฟมโตแกรม (fg) และอัตราการขยายพันธุ์เร็วกว่าผลิตภัณฑ์คู่แข่ง

รูปที่ 1 ปฏิกิริยา RT-LAMP เกิดขึ้นโดยใช้ Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (สีส้ม) และเอนไซม์ Bst ของคู่แข่ง N (สีเทา) และคู่แข่ง T (สีน้ำเงิน) เพื่อขยาย SARS-CoV-2 ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase สามารถเข้าถึงเกณฑ์ได้เร็วกว่าผลิตภัณฑ์คู่แข่งเสมอ และอัตราการขยายยังเร็วกว่าอีกด้วย

4. คำแนะนำการเลือกผลิตภัณฑ์

ผลิตภัณฑ์ที่จัดทำโดย Yeasen มีดังต่อไปนี้:

ตารางที่ 1.ข้อมูลสินค้า