แอนติบอดี DNA polymerase anti-TAQ DNA-TAQ เพื่อช่วยลดการขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจง

การวินิจฉัยระดับโมเลกุลเป็นสาขาย่อยที่พัฒนาเร็วที่สุดในสาขา IVD ซึ่งมีข้อดีคือเวลาในการตรวจจับสั้น ความไวสูง และความจำเพาะสูง มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวินิจฉัยพร้อมกันของเนื้องอกและการคัดกรองโรคติดเชื้อและโรคทางพันธุกรรม ในด้านการวินิจฉัยระดับโมเลกุล PCR ไม่เพียงแต่เป็นแพลตฟอร์มเทคโนโลยีที่โตเต็มที่ที่สุดที่มีส่วนแบ่งการตลาดมากที่สุดเท่านั้น แต่ยังเป็นเทคโนโลยี "มาตรฐานทองคำ" สำหรับการวินิจฉัยทางคลินิกอีกด้วย ในปฏิกิริยา PCR แบบดั้งเดิม ปัญหาการขยายแบบไม่จำเพาะมักเกิดขึ้น การขยายแบบไม่จำเพาะส่งผลโดยตรงต่อการตีความผลการตรวจจับและจะนำไปสู่การลดลงของความไวในการขยายและแม้แต่ผลผลิตของชิ้นส่วนเป้าหมาย การขยายแบบไม่จำเพาะเกิดขึ้นได้อย่างไรและจะหลีกเลี่ยงได้อย่างมีประสิทธิภาพได้อย่างไร

1. DNA โพลิเมอเรสแบบธรรมดาสามารถนำไปสู่การขยายแบบไม่จำเพาะได้

2. โพลีเมอเรสแบบ Hot Start สามารถปรับปรุงความจำเพาะในการขยายสัญญาณได้

3. แอนติบอดี Taq แบบบล็อกคู่สามารถปรับปรุงความจำเพาะและเสถียรภาพของการขยายสัญญาณได้เป็นสองเท่า

4. จอแสดงผลการทำงานของ Yeasenแท็คดับเบิ้ลบล็อค แอนติบอดี

5. ข้อมูลสินค้า

1. DNA โพลิเมอเรสแบบธรรมดาสามารถนำไปสู่การขยายแบบไม่จำเพาะได้

ความจำเพาะของลำดับไพรเมอร์ที่ไม่ดีคือสาเหตุโดยตรงของการขยายแบบไม่จำเพาะ ในฐานะโปรโมเตอร์ของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบธรรมดา กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสของไพรเมอร์สามารถตัดทอนลำดับไพรเมอร์ดีเอ็นเอระหว่างการเตรียมระบบ PCR เพื่อลดความจำเพาะของไพรเมอร์

นอกจากนี้ DNA โพลีเมอเรสแบบธรรมดาไม่เพียงแต่มีกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสเท่านั้น แต่ยังมีกิจกรรมโพลีเมอเรสด้วย แม้ว่าอุณหภูมิการขยายที่เหมาะสมที่สุดของ DNA โพลีเมอเรสจะอยู่ที่ 72℃ แต่โพลีเมอเรสก็ยังคงทำงานที่อุณหภูมิห้อง ดังนั้น ในระหว่างการเตรียมปฏิกิริยา PCR และกระบวนการให้ความร้อนเบื้องต้น ไพรเมอร์อาจสร้างพันธะที่ไม่จำเพาะกับเทมเพลตสายเดี่ยวบางชนิดและขยายตัวภายใต้การกระทำของ Taq DNA โพลีเมอเรส ส่งผลให้ลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมายขยายตัวและส่งผลต่อความจำเพาะของปฏิกิริยา

ดังนั้นระบบ PCR จึงมักถูกกำหนดค่าบนน้ำแข็งเพื่อยับยั้งกิจกรรมของ DNA โพลิเมอเรส แม้ว่าวิธีนี้จะง่ายและราคาถูก แต่ก็ไม่สามารถยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ได้อย่างสมบูรณ์ ดังนั้นจึงไม่สามารถกำจัดการขยายของผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะได้

2. โพลิเมอเรสแบบ Hot Start สามารถปรับปรุงความจำเพาะของการขยายสัญญาณได้

พอลิเมอเรสแบบ Hot Start เป็นองค์ประกอบหลักของ PCR แบบ Hot Start ที่อุณหภูมิห้อง ไซต์ที่ใช้งานของ DNA พอลิเมอเรสจะถูกบล็อกโดยตัวดัดแปลงเอนไซม์ หลังจากการเปลี่ยนสภาพ PCR ที่อุณหภูมิ 95℃ เท่านั้น ตัวดัดแปลงเอนไซม์จึงจะหมดลงและกิจกรรมของเอนไซม์จึงเริ่มต้นขึ้น โดยหลีกเลี่ยงการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากเอนไซม์

ปัจจุบัน วิธีการดัดแปลงดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบฮอตสตาร์ตที่ใช้กันทั่วไปในตลาด ได้แก่ วิธีทางเคมี วิธีลิแกนด์ และวิธีแอนติบอดี โดยในจำนวนนี้ โพลีเมอเรสแบบฮอตสตาร์ตที่ดัดแปลงด้วยแอนติบอดีจะมีประสิทธิภาพการบล็อกที่ดีที่สุด และความเร็วในการปลดปล่อยเอนไซม์ก็รวดเร็ว ซึ่งสามารถลดเวลาปฏิกิริยาของ PCR ได้อย่างมาก ถือเป็นวิธีการดัดแปลงเอนไซม์แบบฮอตสตาร์ตที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในตลาด IVD

อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่าวิธีการสตาร์ทแอนติบอดีแบบดั้งเดิมแบบฮอตสตาร์ตจะบล็อกเฉพาะกิจกรรมโพลีเมอเรส 5'→3' ของโพลีเมอเรส Taq DNA เท่านั้น ซึ่งสามารถป้องกันการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากความไม่ตรงกันหรือไดเมอร์ไพรเมอร์ที่อุณหภูมิต่ำได้เท่านั้นอย่างไรก็ตาม ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น โพลีเมอเรสของ Taq DNA ไม่เพียงแต่มีกิจกรรมโพลีเมอเรส 5'→3' เท่านั้น แต่ยังมีกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 5'→3' อีกด้วย กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสนี้อาจนำไปสู่การเสื่อมสภาพของโพรบที่ไม่ตรงกันหรือวัสดุอื่นๆ ที่อุณหภูมิต่ำ ส่งผลให้มีสัญญาณที่ไม่จำเพาะบางอย่าง

3. แอนติบอดี Taq แบบบล็อกคู่สามารถปรับปรุงความจำเพาะและเสถียรภาพของการขยายสัญญาณได้เป็นสองเท่า

ในฐานะผู้นำด้านนวัตกรรมในอุตสาหกรรมเอนไซม์โมเลกุลในประเทศ Yeasen บริษัท ไบโอเทคโนโลยี (เซี่ยงไฮ้) จำกัด (ต่อไปนี้จะเรียกว่า Yeasen) มุ่งเน้นที่การวิจัยและพัฒนาและการผลิตวัตถุดิบเอนไซม์ระดับโมเลกุลและกล้าที่จะสร้างสรรค์สิ่งใหม่ ๆ โดยอาศัยแพลตฟอร์มคัดกรองแอนติบอดีที่เป็นผู้ใหญ่ของตนเอง โดยคัดกรองแอนติบอดีที่ปิดกั้นด้วย Taq DNA polymerase เป็นโมเลกุลเป้าหมาย หลังจากหลายปีของการวิจัยอย่างพิถีพิถันและการปรับปรุงระบบให้เหมาะสม บริษัทได้พัฒนา แอนติบอดีโพลีเมอเรสดีเอ็นเอ Taq แบบบล็อกคู่ไม่เพียงแต่สามารถบล็อกกิจกรรมโพลีเมอเรสของ Taq DNA polymerase เท่านั้น แต่ยังบล็อกกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสของ Taq DNA polymerase ได้อีกด้วย โดยแนวทางสองทางนี้ไม่เพียงแต่สามารถป้องกันการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากความไม่ตรงกันหรือไดเมอร์ไพรเมอร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพเท่านั้น แต่ยังป้องกันการเสื่อมสภาพของวัสดุจากการสร้างสัญญาณแบบไม่จำเพาะ และปรับปรุงเสถียรภาพของรีเอเจนต์เป็นสองเท่าอีกด้วย

4. การแสดงประสิทธิภาพของ Yeasenแท็คดับเบิ้ลบล็อค แอนติบอดี

4.1 การใช้แอนติบอดี Double-Block Taq มีความแม่นยำและละเอียดอ่อนมากขึ้น

หลังจากการบล็อก Taq polymerase ด้วย Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่ และแอนติบอดีของบริษัท T ตรวจพบตัวอย่างเชิงบวกด้วย ARMS-PCR

รูปที่ 1. เส้นโค้งการขยายพันธุ์ของ ARMS-PCR สีฟ้า : บริษัท ที บล็อคแอนตี้บอดี ; สีแดง: Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่

จากรูปที่ 1 จะเห็นได้ว่าโพลีเมอเรส Taq ที่ถูกบล็อกโดย Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่มีการพิมพ์ที่แม่นยำและมีความไวที่สูงกว่าในการขยายสัญญาณ ARMS-PCR

4.2 แอนติบอดี Taq แบบบล็อกคู่มีประสิทธิภาพ ปิดกั้นกิจกรรม Exonuclease ของ Taq DNA Polymerase

โพรบไพรเมอร์ที่สังเคราะห์จะจับคู่กับสารละลายปฏิกิริยาของโพลีเมอเรส Taq DNA ที่ถูกบล็อกโดยแอนติบอดีที่ไม่ปิดและที่ถูกบล็อกสองชั้นตามลำดับ และทำปฏิกิริยาที่ 40℃ เพื่อตรวจจับสัญญาณการเรืองแสงของพวกมัน

รูปที่ 2 การตรวจจับประสิทธิภาพการบล็อกของแอนติบอดีบล็อกคู่สำหรับกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส สีเหลือง: กลุ่มดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Taq ที่ไม่ปิด สีม่วง: กลุ่มดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Taq ถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีบล็อกคู่

จะเห็นได้จากรูปที่ 2 ซึ่งแอนติบอดีบล็อกคู่สามารถบล็อกกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสของ Taq DNA โพลิเมอเรสได้อย่างมีประสิทธิภาพ

4.3 แอนติบอดี Taq แบบบล็อกคู่สามารถปรับปรุงเสถียรภาพของรีเอเจนต์การตรวจจับได้อย่างมีประสิทธิภาพ

โพลีเมอเรสของดีเอ็นเอ Taq ถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีบล็อกแบบดั้งเดิมและแอนติบอดีบล็อกคู่ตามลำดับ และกำหนดค่าเป็นพรีมิกซ์เต็มรูปแบบที่มีไพรเมอร์โพรบ พลาสมิด ASF 10,000 ชุดถูกขยายที่ 4℃ เป็นเวลา 10 วันหรือที่ 37℃ เป็นเวลา 1, 3 และ 5 วัน สังเกตการเปลี่ยนแปลงของเส้นโค้งการขยายและค่า Ct และเปรียบเทียบผลของแอนติบอดีบล็อกแบบดั้งเดิมและแอนติบอดีบล็อกคู่ต่อเสถียรภาพของสารละลายปฏิกิริยาพรีมิกซ์เต็มรูปแบบ

รูปที่ 3.เส้นโค้งการขยายของพลาสมิด ASF จำนวน 10,000 ชุดที่ขยายด้วยสารละลายปฏิกิริยาการบล็อกแอนติบอดีแบบดั้งเดิม (a) และแอนติบอดีบล็อกคู่ (b) สีฟ้า: เก็บที่ 4℃ เป็นเวลา 10 วัน; สีแดง : วางไว้ที่ 4℃ เป็นเวลา 0 วัน (ควบคุม)

จากรูปที่ 3 จะเห็นได้ว่าแอนติบอดีแบบบล็อกคู่สามารถรักษาเสถียรภาพของสารละลายปฏิกิริยาและปรับปรุงเสถียรภาพของรีเอเจนต์ตรวจจับได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าแอนติบอดีแบบบล็อกแบบเดิม เส้นโค้งการขยายและค่า Ct ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากที่พรีมิกซ์ทั้งหมดที่มีไพรเมอร์ถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีแบบบล็อกคู่และวางที่ 4℃ เป็นเวลา 10 วัน

รูปที่ 4 กราฟการขยายพลาสมิด ASF จำนวน 10,000 ชุดที่ขยายด้วยสารละลายปฏิกิริยาการบล็อกแอนติบอดีแบบดั้งเดิม (a) และแอนติบอดีแบบบล็อกคู่ (b) สีฟ้า: เก็บที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 5 วัน; สีเขียว: 37℃ เป็นเวลา 3 วัน; สีเหลือง: 37℃ ต่อ 1 วัน; สีแดง : วางไว้ที่ 37℃ เป็นเวลา 0 วัน (ควบคุม)

จากรูปที่ 4 จะเห็นได้ว่าแอนติบอดีแบบบล็อกคู่สามารถรักษาเสถียรภาพของสารละลายปฏิกิริยาและปรับปรุงเสถียรภาพของรีเอเจนต์ตรวจจับได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าแอนติบอดีแบบบล็อกแบบเดิม แอนติบอดีแบบบล็อกคู่จะบล็อกพรีมิกซ์ทั้งหมดที่มีไพรเมอร์-โพรบ และความแตกต่างของค่า Ct จะน้อยกว่า 0.2 หลังจากวางไว้ที่ 37℃ เป็นเวลา 1, 3 และ 5 วัน

4.4 แอนติบอดี Taq แบบบล็อกคู่ช่วยแก้ปัญหาการเคลื่อนตัวของเส้นฐาน

เมื่อไพรเมอร์บางตัวทำงานร่วมกับบัฟเฟอร์และเครื่องมือเฉพาะ จะเกิดการดริฟท์เส้นพื้นฐาน Yeasen ได้พยายามใช้วิธีต่างๆ มากมายเพื่อปรับปรุงปัญหาพื้นฐาน และพบว่าแอนติบอดีแบบบล็อกคู่จะช่วยให้มีพื้นฐานที่เสถียรได้ดีกว่า

รูปที่ 5 กราฟการขยายตัวของยีน N (a) และยีน ACT (b) สีแดง: แอนตี้บอดีบล็อกแบบดั้งเดิม สีเขียว: แอนติบอดีบล็อกคู่

จากภาพที่ 5 จะเห็นได้ว่าการใช้แอนติบอดีบล็อกคู่ภายใต้ไพรเมอร์และบัฟเฟอร์เฉพาะสามารถช่วยแก้ปัญหาการดริฟต์ของค่าพื้นฐานได้

4.5 ได้ความเป็นเส้นตรงที่ดีจากการใช้แอนติบอดีแบบ Double-Block Taq

พลาสมิดคู่ ASF/ACT จำนวน 100,000, 10,000, 1000 และ 100 ชุด ได้รับการขยายโดยที่สารละลายปฏิกิริยาถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีแบบบล็อกคู่ และสร้างกราฟมาตรฐานขึ้นมา

รูปที่ 6 กราฟมาตรฐานของยีน ASF (a) และยีน ACT (b) ที่สร้างโดยสารละลายปฏิกิริยาบล็อกคู่

จากรูปที่ 6 จะเห็นได้ว่าเส้นโค้งมาตรฐาน R2 ของยีน ASF คือ 0.998 และประสิทธิภาพการขยายพันธุ์คือ 98.848% กราฟมาตรฐาน R2 ของยีน ACT อยู่ที่ 0.998 และประสิทธิภาพการขยายพันธุ์อยู่ที่ 98.113%

4.6 การวางบล็อกคู่ แอนติบอดีสามารถปลดปล่อยกิจกรรมเอนไซม์ได้อย่างรวดเร็ว

โพลีเมอเรส Taq ถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีของบริษัท T ที่นำเข้าและ Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่ (cat#31303) ตามลำดับ และตรวจพบกิจกรรมเอนไซม์หลังจากเกิดภาวะช็อกจากความร้อนที่อุณหภูมิ 95℃ เป็นเวลา 20 วินาที จะเห็นได้ว่า 31303 สามารถปลดปล่อยกิจกรรมเอนไซม์ได้มากกว่า 95% หลังจากเกิดภาวะช็อกจากความร้อนที่อุณหภูมิ 95℃ เป็นเวลา 20 วินาที ซึ่งเทียบเท่ากับแอนติบอดีของบริษัท T

ตารางที่ 1 กิจกรรมเอนไซม์

4.7 กลยุทธ์บล็อกคู่ แอนติบอดี สามารถบล็อคเอนไซม์ Taq ได้หลายชนิด

เอนไซม์ Taq สามประเภท (ชนิดป่าและชนิดกลายพันธุ์ 2 ชนิด) ถูกบล็อกโดย Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่ของ (cat#31303) และอัตราส่วนการบล็อกคือ 1 μ g: 5 U โดยวัดค่าการเรืองแสงและประสิทธิภาพการปิดผนึก จะเห็นได้ว่าผลการบล็อกของ Yeasenแอนติบอดีบล็อกคู่ (หมายเลขแมว #31303) ดีต่อเอนไซม์ Taq หลายประเภท

ตารางที่ 2. ประสิทธิภาพการบล็อคของเอนไซม์ Taq ชนิดต่างๆ

4.8 Yeasenของ แอนติบอดี Double-Block Taq ไม่มีสารตกค้างจีโนมในหนู

โดยใช้น้ำเป็นแม่แบบสำหรับการควบคุมเชิงลบและใช้จีโนมของหนูเป็นแม่แบบสำหรับการควบคุมเชิงบวก พบว่ามีการขยายพันธุ์ชุดต่างๆ จำนวน 31,303 ชุด พบว่าชิ้นส่วนเป้าหมายไม่ได้รับการขยายพันธุ์ในตัวอย่าง ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีจีโนมของหนูตกค้างอยู่ในแอนติบอดี

รูปที่ 7 แผนภาพการตรวจจับสารตกค้างจีโนมของหนู

หมายเหตุ: - คือตัวควบคุมเชิงลบ + คือตัวควบคุมเชิงบวก และ 1-5 คือตัวอย่าง 31,303 ตัวอย่างจากชุดที่แตกต่างกัน

5. ข้อมูลผลิตภัณฑ์