dNTP ย่อมาจาก patterned ribonucleotide triphosphate ซึ่งใช้ใน PCR ซึ่งสามารถขยายสาย DNA ที่กำลังเติบโตได้ กล่าวอีกนัยหนึ่ง dNTP ใน PCR มีสาย DNA ที่เสริมกันผ่านพันธะไฮโดรเจน และสาย DNA ที่กำลังเติบโตจะขยายออกด้วยความช่วยเหลือของ Taq DNA polymerase dNTP มีประโยชน์เฉพาะอย่างไรใน PCR? dNTP ที่มีความบริสุทธิ์สูงจำเป็นต้องมีคุณสมบัติอะไรบ้าง?

1. dNTPs คืออะไร?
2. ความเข้มข้นของ dNTP ใน PCR คือเท่าไร?
3. คุณสมบัติที่จำเป็นของ dNTP ความบริสุทธิ์สูงคืออะไร
4. ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องและประสิทธิภาพ

1. dNTPs คืออะไร?

ดีออกซีนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (dNTP) คือนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟตที่ประกอบด้วยดีออกซีไรโบส ซึ่งเป็นสายนิวคลีโอไทด์ที่ประกอบด้วยไรโบส เบส และฟอสเฟต dNTP เป็นองค์ประกอบพื้นฐานที่สำคัญของโมเลกุลกรดนิวคลีอิก และเป็นส่วนประกอบที่จำเป็นของส่วนผสม PCR เนื่องจากไม่สามารถสร้าง DNA ที่ขยายใหม่ได้หากไม่มีดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดที่ประกอบเป็นลำดับ DNA ได้แก่ ดีออกซีอะดีโนซีนไตรฟอสเฟต (dATP) ดีออกซีไทมิดีนไตรฟอสเฟต (dTTP) ดีออกซีไซติดีนไตรฟอสเฟต (dCTP) และดีออกซีกัวโนซีนไตรฟอสเฟต (dGTP) นอกจากนี้ คุณภาพของ dNTP ยังมีความสำคัญต่อความสำเร็จของขั้นตอนต่างๆ เช่น PCR การสังเคราะห์ cDNA qPCR การจัดลำดับ การโคลน และการติดฉลาก DNA

มี dNTP หรือดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟตอยู่ 4 ประเภท โดยแต่ละประเภทใช้เบสของ DNA ที่แตกต่างกัน ได้แก่ อะดีนีน (dATP) ไซโทซีน (dCTP) กัวนีน (dGTP) และไทมีน (dTTP) การใช้ dNTP ในช่วงการขยายพันธุ์จะทำให้ได้เบสเดี่ยวที่พร้อมจะเข้าไปใน DNA และเพิ่มเป็นสองเท่า เหมือนกับเป็นส่วนประกอบพื้นฐาน เนื่องจากจุดประสงค์ของเทคนิคนี้คือการสังเคราะห์ DNA ใหม่ dNTP จึงจัดเตรียมนิวคลีโอไทด์ให้กับสาย "ที่คลายซิป" โดยใช้เทมเพลตของด้านเดียว วิธีนี้จะเปลี่ยนสาย DNA เดียวให้เป็นสองสาย และสามารถดำเนินต่อไปแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลได้ตราบเท่าที่รีเอเจนต์ยังคงอยู่จนถึงขั้นตอนการกักเก็บขั้นสุดท้าย

2. ความเข้มข้นของ dNTP ใน PCR คือเท่าไร?

PCR เป็นเทคนิคสังเคราะห์ DNA ในหลอดทดลองที่ดำเนินการเพื่อสร้างสำเนาของชิ้นส่วน DNA ที่น่าสนใจหลายชุดเพื่อให้สามารถมองเห็นได้ภายใต้อิเล็กโทรโฟรีซิสเจล วัตถุประสงค์ของ PCR คือการสร้างสำเนา DNA จำนวนมากสำหรับการประยุกต์ใช้งานต่างๆ ในลำดับ DNA หรือไมโครอาร์เรย์ DNA ส่วนประกอบของ PCR ได้แก่ เทมเพลต DNA ไพรเมอร์ บัฟเฟอร์ และ Taq DNA polymerase dNTP เพื่อทำความเข้าใจกลไกของ PCR จำเป็นต้องเข้าใจความสำคัญและหลักการของส่วนประกอบที่ใช้ dNTP เป็นส่วนประกอบสำคัญอย่างหนึ่งของ PCR หน้าที่ของ dNTP ใน PCR คือการขยายสาย DNA ที่กำลังเติบโตด้วยความช่วยเหลือของ Taq DNA polymerase และรวมเข้ากับสาย DNA ที่เสริมกันผ่านพันธะไฮโดรเจน

กระบวนการ PCR แบ่งออกเป็น 3 ขั้นตอนที่ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ ได้แก่ การเปลี่ยนสภาพ การอบอ่อน และการยืดออก ในระหว่างขั้นตอนการเปลี่ยนสภาพ DNA สายคู่จะถูกเปลี่ยนสภาพเป็น DNA สายเดี่ยว ในระหว่างขั้นตอนการอบอ่อน ไพรเมอร์จะจับที่ตำแหน่งที่แน่นอนของลำดับที่เติมเต็มของพวกมัน และในระหว่างขั้นตอนการขยายพันธุ์ โพลิเมอเรสของ Taq DNA จะเพิ่ม dNTP ลงในสาย DNA ที่กำลังเติบโต เมื่อสายถูกเปิดออกและไพรเมอร์จับกับ DNA สายเดี่ยว โพลิเมอเรสของ Taq DNA จะเริ่มกิจกรรมเร่งปฏิกิริยา ในขั้นตอนถัดไป การเติม dNTP จะเริ่มต้นขึ้น ซึ่งจะจับกับคอมเพล็กซ์ P-DNA ด้วยความสัมพันธ์ที่น้อยลงหากมีนิวคลีโอไทด์ที่เติมเต็มที่แน่นอน ไม่นานหลังจากที่โพลิเมอเรสของ Taq DNA เกิดขึ้น ปฏิสัมพันธ์พันธะไฮโดรเจนระหว่างเบสที่เติมเต็มและ dNTP จะเกิดขึ้น ที่นี่ไม่ใช่ทั้งนิวคลีโอไทด์ในตอนเริ่มต้น แต่เป็นเบส (เบสไนโตรเจน) บน dNTP ที่จะตัดสินใจว่าจะจับหรือไม่ประการแรก หากพบเบสที่เสริมกัน (A สำหรับ T, G สำหรับ C) บนเทมเพลต ssDNA มันจะสร้างพันธะไฮโดรเจนระหว่างเบสทั้งสอง พันธะไฮโดรเจนสามพันธะระหว่าง C และ G และพันธะไฮโดรเจนสองพันธะระหว่าง A และ T เกิดขึ้นเมื่อพันธะไฮโดรเจนเกิดขึ้นแล้ว โพลีเมอเรสของ Taq DNA จะสอดคล้องกับการรวมตัวของ dNTP เข้ากับสาย DNA ที่กำลังเติบโตโดยสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ ตอนนี้ หลังจากพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์เกิดขึ้นแล้ว โพลีเมอเรสของ Taq DNA จะก้าวไปอีกขั้นโดยการเพิ่ม dNTP ใหม่ พันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์เกิดขึ้นระหว่าง 3'OH ของไพรเมอร์และ 5'P ของ dNTP หลังจากพันธะไฮโดรเจน โพลีเมอเรสของ Taq DNA จะเร่งปฏิกิริยาโดยการกำจัดแกมมาและเบตาฟอสเฟตออกจากไตรฟอสเฟตของ dNTP เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสิ้น ไพโรฟอสเฟต (PPi) สองชนิดจะถูกปล่อยออกมา แต่จลนพลศาสตร์ที่แน่นอนของ dNTP และปฏิกิริยาโพลีเมอเรสของ Taq ในปฏิกิริยา PCR ยังคงไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด

โดยทั่วไปแล้วนิวคลีโอไทด์ทั้งสี่นี้จะถูกเติมลงในปฏิกิริยา PCR ในปริมาณที่เท่ากันเพื่อให้เกิดการรวมเบสที่เหมาะสมที่สุด อย่างไรก็ตาม ในบางสถานการณ์ เช่น การกลายพันธุ์แบบสุ่มโดย PCR ความเข้มข้นของ dNTP ที่ไม่สมดุลจะถูกป้อนเข้าไปโดยเจตนาเพื่อส่งเสริมให้เกิดการรวมเบสผิดพลาดในระดับที่สูงขึ้นโดยดีเอ็นเอโพลีเมอเรสที่ไม่ผ่านการตรวจสอบ ปัจจัยที่กำหนดความเข้มข้นต่ำสุดของ dNTP คือความยาวของดีเอ็นเอและองค์ประกอบของลำดับเป้าหมาย ในปฏิกิริยา PCR dNTP โดยทั่วไปจะมีค่าอยู่ที่ 50-200 μmol/L เมื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ dNTP มากกว่า 50 mmol/L ก็สามารถยับยั้งกิจกรรมของดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Taq ได้ ความเข้มข้นของ dNTP ทั้งสี่ควรเท่ากันเพื่อลดการรวมเบสผิดพลาดระหว่างการขยายเนื่องจากไม่มี dNTP หนึ่งตัว

ในการใช้งาน PCR ทั่วไป ความเข้มข้นสุดท้ายที่แนะนำของ dNTP แต่ละตัวมักจะอยู่ที่ 0.2 mM ความเข้มข้นที่สูงขึ้นอาจมีประโยชน์ในบางกรณี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่มี Mg ความเข้มข้นสูง²⁺, เป็นแมกนีเซียม²⁺ จับกับ dNTP และลดอัตราการรวมตัว ทำให้เพิ่มอัตราการไม่จำเพาะ dNTP มีฟอสเฟตซึ่งสามารถรวมกับ Mg ได้²⁺ เพื่อลดความเข้มข้นของแมกนีเซียมอิสระ²⁺ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นจะส่งผลต่อความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของ Mg²⁺ภายใต้สภาวะที่มีความเข้มข้นสูงของ DNA และ dNTP Mg²⁺ ควรปรับความเข้มข้นให้เหมาะสม นอกจากนี้ dNTP ที่มีน้อยยังทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR ไม่สมบูรณ์ อย่างไรก็ตาม dNTP ที่เกินความเข้มข้นที่เหมาะสมอาจยับยั้ง PCR ได้ เพื่อให้การรวมเข้ากับ DNA โพลิเมอเรสมีประสิทธิภาพ ควรมี dNTP ที่เป็นอิสระอยู่ในปฏิกิริยาที่ความเข้มข้นไม่น้อยกว่า 0.01-0.015 มิลลิโมลาร์

3. คุณสมบัติที่จำเป็นของ dNTP ความบริสุทธิ์สูงคืออะไร

นับตั้งแต่มีการค้นพบ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสถือเป็นเครื่องมือที่ไม่มีใครเทียบได้ที่ใช้ในการวิจัยทางพันธุกรรมระดับโมเลกุล dNTP ถูกนำมาใช้ใน PCR เพื่อขยายสาย DNA ที่กำลังเติบโต แม้ว่าคุณภาพของ dNTP ในระบบจะแย่ก็ตาม แต่ก็จะส่งผลเชิงลบต่อคุณสมบัติของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย YeasendNTP ที่มีความบริสุทธิ์สูงเหมาะสำหรับการสังเคราะห์ DNA ที่มีความละเอียดอ่อนและทำซ้ำได้ทุกประเภท

Yeasen นำเสนอนิวคลีโอไทด์เกรด GMP พร้อมใช้ ชุดและส่วนผสมที่จัดหาในรูปเกลือโซเดียมในน้ำบริสุทธิ์ที่ pH 7.0 กระบวนการผลิตจะขจัดสิ่งเจือปนและสารยับยั้งเฉพาะ PCR และ dNTP ได้รับการผลิตขึ้นเป็นพิเศษสำหรับการใช้งานทางชีววิทยาโมเลกุล dNTP ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วย HPLC แบบเตรียมและมีความบริสุทธิ์อย่างน้อย 99% สามารถใช้ในกระบวนการ PCR, RT-qPCR, LAMP, การติดฉลาก DNA และการจัดลำดับ DNA
มาตรฐานการควบคุมที่เข้มงวดและเทคโนโลยีที่ทันสมัยทำให้มั่นใจได้ว่าผลิตภัณฑ์จะมีคุณภาพดีที่สุด dNTP แต่ละล็อตจะได้รับการทดสอบสารตกค้างต่างๆ (ดีเอ็นเอของแบคทีเรีย ดีเอ็นเอของมนุษย์ DNase RNase และเอนโดนิวคลีเอส)ผลิตภัณฑ์มีเสถียรภาพจากชุดหนึ่งไปสู่อีกชุดหนึ่ง และเหมาะสำหรับการสังเคราะห์ DNA ที่มีความละเอียดอ่อนและทำซ้ำได้สูงทุกประเภท

4. ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องและประสิทธิภาพ

4.1 ไม่มีสารตกค้างของ DNA จากแบคทีเรีย

รูปที่ 1 ผลการตรวจจับแสดงให้เห็นว่า dNTP ไม่มีสารตกค้างจีโนมแบคทีเรีย

4.2 ไม่มีสารตกค้างของดีเอ็นเอของมนุษย์

รูปที่ 2 ผลการตรวจจับแสดงให้เห็นว่า dNTP ไม่มีสารตกค้างจีโนมของมนุษย์

4.3 ไม่มีการปนเปื้อนของ DNase, RNase และ Endonuclease

รูปที่ 3 ผลการตรวจจับแสดงให้เห็นว่า dNTP ไม่มี DNase, RNase และ Endonuclease

4.4 การขยาย PCR (DNA 20 kb)

รูปที่ 4 ผลการขยาย PCR คือผลิตภัณฑ์ที่คาดหวังขนาด 20 กิโลเบส

4.5 ข้อมูลผลิตภัณฑ์

ผลิตภัณฑ์ที่จัดทำโดย Yeasen มีดังนี้.

ตารางที่ 1.ข้อมูลสินค้า