ตั้งแต่เดือนมีนาคม 2022 สายพันธุ์กลายพันธุ์ Omicron ที่เจ้าเล่ห์ได้ทำลายชีวิตที่สงบสุขของผู้คนอีกครั้ง การระบาดของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ได้เกิดขึ้นทั่วประเทศและส่งผลกระทบต่อ 30 จังหวัด (เขตปกครองตนเองและเทศบาล) เนื่องจากเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการป้องกันและควบคุมการแพร่ระบาดของ SARS-CoV-2 ได้อย่างแม่นยำ การตรวจหากรดนิวคลีอิกจึงกลายเป็นวิถีชีวิตปกติ "คุณทำการตรวจกรดนิวคลีอิกวันนี้หรือไม่" นอกจากนี้ยังกลายเป็นคำทักทายประจำวันของผู้คนอีกด้วย เมื่อพูดถึงเรื่องนี้ คุณรู้หรือไม่ว่าวัตถุดิบหลักใดบ้างที่จำเป็นในการตรวจจับกรดนิวคลีอิก บทความนี้จะแนะนำวัตถุดิบหลักที่สำคัญในเอนไซม์ตรวจจับกรดนิวคลีอิก

1. กระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกสำหรับ SARS-CoV-2

2. เอนไซม์หลักในการสกัดกรดนิวคลีอิก

3. เอนไซม์หลักในระหว่างการทำ RT-qPCR

4. เอนไซม์หลักของการตรวจหากรดนิวคลีอิก SARS-CoV-2 จาก Yeasen

1. กระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกสำหรับ SARS-CoV-2

เอนไซม์เป็นไบโอแคตาลิสต์ประเภทหนึ่งที่มีความสำคัญอย่างยิ่ง โดยมีประสิทธิภาพในการเร่งปฏิกิริยาสูงและปฏิกิริยาที่มีความจำเพาะสูง ปฏิกิริยาทางชีวเคมีส่วนใหญ่ต้องอาศัยเอนไซม์ ในกระบวนการตรวจจับ 2019-nCoV ด้วยกรดนิวคลีอิก (แสดงในรูปที่ 1) เอนไซม์โมเลกุลประเภทต่างๆ มีบทบาทสำคัญในขั้นตอนการทดลองต่างๆ เช่น การสกัดกรดนิวคลีอิกและ RT-qPCR ต่อไปนี้ เราจะแยกวัตถุดิบเอนไซม์หลักที่ใช้ในกระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกตามความเชื่อมโยงในการทดลองต่างๆ

รูปที่ 1 กระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกสำหรับ SARS-CoV-2

2. เอนไซม์หลักในการสกัดกรดนิวคลีอิก

กระบวนการสกัดกรดนิวคลีอิกของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ประกอบด้วย 2 ขั้นตอนหลัก ได้แก่ การไลซิสและการทำให้บริสุทธิ์ การไลซิสคือกระบวนการทำลายโครงสร้างเซลล์ของตัวอย่างเพื่อให้กรดนิวคลีอิกในตัวอย่างเป็นอิสระในระบบไลซิส การทำให้บริสุทธิ์คือการแยกกรดนิวคลีอิกออกจากส่วนประกอบอื่นๆ ในระบบไลซิสอย่างสมบูรณ์ เช่น โปรตีน เกลือ และสิ่งเจือปนอื่นๆ และกระบวนการปฏิกิริยาต้องอาศัยการมีส่วนร่วมของโปรตีเนส K, ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I และสารยับยั้ง RNase

2.1 โปรตีเอสเค

โปรตีเนสเคเป็นซีรีนโปรตีเอสที่มีกิจกรรมการแตกตัวที่กว้าง โดยไซต์การแตกตัวคือพันธะเปปไทด์ปลายคาร์บอกซีของกรดอะมิโนอะลิฟาติกและอะโรมาติก (รูปที่ 2) ในกระบวนการสกัดกรดนิวคลีอิก โปรตีเนสเคสามารถย่อยสลายฮิสโตนซึ่งจับกับกรดนิวคลีอิกได้อย่างแน่นหนา ส่งเสริมการแยกกรดนิวคลีอิก และทำให้สกัดกรดนิวคลีอิกตัวอย่างได้ง่ายขึ้น นอกจากนี้ โปรตีเนสเคยังสามารถย่อยสลายกิจกรรมของอาร์เอ็นเอไฮโดรเลส (RNase) และยับยั้งการไฮโดรไลซิสของอาร์เอ็นเอเทมเพลตด้วย RNase

รูปที่ 2 แผนผังของพันธะเปปไทด์ไฮโดรไลซ์ของโปรตีเนส K

Yeasen ไบโอเทค โปรตีเนส เค (Cat#10401ES) ได้มาจากสายพันธุ์ยีสต์รีคอมบิแนนท์ มีกิจกรรมจำเพาะ ≥30 U/มก. ปราศจาก RNase และ DNase และมีกิจกรรมเอนไซม์ที่เสถียรในยูเรียและสารละลาย SDS มีฤทธิ์ในช่วง pH กว้าง (pH 4.0~12.0) เหมาะสำหรับการแยกและกำจัดโปรตีน เช่น การเตรียมตัวอย่างไฮบริดิเซชันในสถานภาพและการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์

2.2 ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I

ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (DNase I) สามารถเร่งปฏิกิริยาการสร้าง DNA ในรูปแบบต่างๆ มีเป้าหมายเพื่อตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ที่อยู่ติดกับไพริมิดีน และสร้างโพลีนิวคลีโอไทด์ที่มีกลุ่มฟอสเฟตอยู่ที่ปลาย 5' และกลุ่มไฮดรอกซิลอยู่ที่ปลาย 3' โดยผลิตภัณฑ์จากการย่อยโดยเฉลี่ยคือโพลีเตตระนิวคลีโอไทด์ที่เล็กที่สุดในกระบวนการสกัดกรดนิวคลีอิก SARS-CoV-2 นั้น DNase I จะถูกใช้เพื่อกำจัดการปนเปื้อนจีโนมในตัวอย่าง RNA หลีกเลี่ยงสารตกค้างของ DNA ในเทมเพลต RNA และปรับปรุงความบริสุทธิ์ของเทมเพลต

Yeasen ไบโอเทค ดีเอ็นเอส ไอ (Cat#10325ES) ได้มาจากสายพันธุ์ E. coli ที่สร้างใหม่ ปราศจาก RNase และสามารถใช้ในการบำบัดตัวอย่าง RNA ต่างๆ ช่วง pH การทำงานที่เหมาะสมคือ 7.0-8.0 ในกรณีที่มี Mg2+ DNase I สามารถแยกส่วน DNA สายคู่ใดๆ แบบสุ่มได้ ในขณะที่ในกรณีที่มี Mn²⁺DNase I สามารถแยก DNA ที่มีสายคู่กันที่ไซต์เดียวกัน โดยสร้างปลายทู่ หรือมีนิวคลีโอไทด์ 1-2 ตัวยื่นออกมามีปลายเหนียว (แสดงในรูปที่ 3)

รูปที่ 3 แผนผังของ DNase I ที่ตัด dsDNA ในสภาพที่มี Mg²⁺ และแมงกานีส²⁺

2.3 สารยับยั้ง RNase

ในกระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกของ SARS-CoV-2 การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกตัวอย่างหรือการเตรียมระบบปฏิกิริยาทดลองอาจทำให้เกิดการปนเปื้อนของไรโบนิวคลีเอส (RNase) ส่งผลให้เทมเพลต RNA เสื่อมสภาพ เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ RNase จำเป็นต้องใช้สารยับยั้ง RNase

RNase Inhibitor เป็นสารยับยั้ง RNase เฉพาะในรกมนุษย์ ซึ่งสามารถจับกับ RNase โดยเฉพาะเพื่อสร้างสารเชิงซ้อนที่มีพันธะที่ไม่ใช่โควาเลนต์และทำให้ RNase ไม่ทำงาน Yeasen ไบโอเทค สารยับยั้ง RNase ของหนู (หมายเลขสินค้า 10603ES) ไม่มีซิสเตอีน 2 ชนิดที่ไวต่อการเกิดออกซิเดชันในโปรตีนของมนุษย์มาก มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงกว่าและสามารถยับยั้ง RNase หลายประเภท (RNase A, B, C) ได้อย่างกว้างขวาง เหมาะสำหรับการทดลองที่ไวต่อไดไธโอไทรทอล (DTT) สูง เช่น qPCR

3. เอนไซม์หลักในระหว่างการทำ RT-qPCR

หลังจากสกัดกรดนิวคลีอิกจากตัวอย่าง SARS-CoV-2 เสร็จแล้ว การตรวจจับกรดนิวคลีอิกสามารถทำได้โดย RT-qPCR ในกระบวนการทดลองเหล่านี้ DNA โพลิเมอเรส รีเวิร์สทรานสคริปเทส และยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส ล้วนเป็นวัตถุดิบเอนไซม์หลักที่จำเป็น

3.1 เอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับ

หลังจากการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์แล้ว RNA ของ SARS-CoV-2 จะต้องมีเอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับเพื่อเร่งปฏิกิริยาพอลิเมอไรเซชันของ dNTP เพื่อสร้างลำดับ cDNA ที่เสริมกับเทมเพลต RNA (รูปที่ 4) สำหรับปฏิกิริยา RT-qPCR ควรเลือกเอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับที่ทนต่ออุณหภูมิสูง ปัจจุบัน เอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับ MMLV ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุด เนื่องจากไม่มีกิจกรรมเอ็นโดนิวคลีเอสของ DNA และมีกิจกรรม RNase H ต่ำ จึงมีข้อได้เปรียบมากกว่าในการโคลน cDNA

รูปที่ 4 แผนผังกระบวนการถอดรหัสย้อนกลับ

Yeasen ไบโอเทค ไฮแฟร์™ วี รีเวิร์สทรานสคริปเทส (Cat#11300ES) เป็นเอนไซม์ทรานสคริพเทสย้อนกลับชนิดใหม่ที่ได้จากเทคโนโลยีทางพันธุวิศวกรรม เอนไซม์นี้มีเสถียรภาพทางความร้อนที่ดีและสามารถทนต่ออุณหภูมิปฏิกิริยาได้สูงถึง 60°C และยังเป็นเอนไซม์ที่มีความเสถียรทางความร้อนสูงอีกด้วย เหมาะสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับของเทมเพลต RNA ที่มีโครงสร้างรองที่ซับซ้อน ในเวลาเดียวกัน เอนไซม์ยังช่วยเพิ่มความสัมพันธ์กับเทมเพลต เหมาะสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับของเทมเพลตจำนวนน้อยและยีนที่มีสำเนาน้อย และสามารถขยาย cDNA ได้ถึง 10 กิโลเบส

3.2 ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

หลังจากกระบวนการถอดรหัสย้อนกลับของเทมเพลตเสร็จสมบูรณ์เพื่อสร้าง cDNA สายคู่ จะต้องใช้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส "ผู้เล่นวิญญาณ" ในปฏิกิริยา PCR เพื่อปรากฏตัว โดยการโพลีเมอไรเซชันดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์อิสระเพื่อขยายสายดีเอ็นเอ และดีเอ็นเอเทมเพลตจำนวนมากจะถูกขยายในหลอดทดลองเพื่อให้บรรลุวัตถุประสงค์ในการตรวจจับกรดนิวคลีอิกของไวรัส

DNA โพลิเมอเรสที่ใช้กันทั่วไปในปฏิกิริยา RT-qPCR คือ Taq DNA โพลิเมอเรสแบบฮอทสตาร์ต เอนไซม์ประเภทนี้จะไม่ทำงานที่อุณหภูมิห้องมีกิจกรรมพอลิเมอไรเซชันเฉพาะหลังจากการสตาร์ทร้อนเท่านั้น ซึ่งสามารถลดการสร้างสัญญาณพื้นหลังได้ ช่วยแก้ปัญหาการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากการสร้างไพรเมอร์-ไดเมอร์หรือการไม่ตรงกันในปฏิกิริยา PCR ทั่วไป ปัจจุบัน วิธีปรับเปลี่ยนการสตาร์ทร้อนของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ การดัดแปลงทางเคมี การดัดแปลงลิแกนด์ และการดัดแปลงแอนติบอดี หลักการของวิธีการปรับเปลี่ยนการสตาร์ทร้อนที่แตกต่างกันแสดงไว้ในรูปที่ 5

รูปที่ 5 แผนผังของเอนไซม์ฮอทสตาร์ทดัดแปลงชนิดต่างๆ

Yeasen ไบโอเทค UNICONTM Hotstart โพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq ที่มีความจำเพาะสูง, 5 U/μL (Cat#10726ES) เป็นดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบฮอตสตาร์ทที่มีการบล็อกคู่ที่มีความสัมพันธ์เทมเพลตสูง ที่อุณหภูมิห้อง ไม่เพียงแต่ 5'→3' กิจกรรมของโพลีเมอเรสถูกบล็อค แต่ 5'→3' ก็เช่นกัน กิจกรรมของเอ็กโซนิวคลีเอสถูกบล็อก การทำให้เสื่อมสภาพที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 30 วินาทีสามารถทำให้แอนติบอดีที่บล็อกไม่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ปลดปล่อยกิจกรรมของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสและกิจกรรมของเอ็กโซนิวคลีเอส คุณลักษณะการบล็อกสองครั้งไม่เพียงแต่สามารถป้องกันการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากความไม่ตรงกันหรือไพรเมอร์ไดเมอร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพเท่านั้น แต่ยังยับยั้งการลดลงของสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ที่เกิดจากการเสื่อมสภาพของโพรบได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกด้วย การรับประกันสองครั้งทำให้รีเอเจนต์ตรวจจับในหลอดทดลองมีเสถียรภาพมากขึ้นระหว่างการขนส่งหรือการใช้งานที่อุณหภูมิห้อง

3.3 ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส

ในกระบวนการตรวจจับกรดนิวคลีอิกของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ มลพิษจากละอองลอยในสภาพแวดล้อมการทำงานเป็นปัจจัยที่พบบ่อยที่สุดที่ทำให้เกิดผลบวกปลอมของ PCR การเติมเอนไซม์ UDG (Uracil DNA Glycosylase, uracil DNA glycosylase) ลงในระบบขยายพันธุ์สามารถกำจัดมลพิษตกค้างจากการขยายพันธุ์ (ส่วนใหญ่อยู่ในรูปของละอองลอย) ที่ผสมอยู่ในระบบ PCR ได้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อให้แน่ใจถึงความแม่นยำของผลการขยายพันธุ์ หลักการต่อต้านมลพิษของเอนไซม์ UDG แสดงไว้ในรูปที่ 6

รูปที่ 6 แผนผังหลักการต่อต้านมลพิษของเอนไซม์ UDG

Yeasen ไบโอเทค ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG/UNG) ไวต่อความร้อน 1 U/μL (Cat#10303ES) จะทำงานที่อุณหภูมิ 25-37°C ไวต่อความร้อน และถูกทำให้ไม่ทำงานอย่างถาวรที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 10 นาทีหรือ 95°C เป็นเวลา 2 นาที ไม่มีเอ็นโดนิวคลีเอสและอาร์เอ็นเนสตกค้าง และจีโนมของแบคทีเรียโฮสต์มีน้อยกว่า 10 สำเนา สามารถใช้ร่วมกับโพลีเมอเรสดีเอ็นเอ Taq แบบเริ่มต้นร้อนเพื่อให้แน่ใจว่าปฏิกิริยาการขยายมีความจำเพาะ

4.เอนไซม์หลักของการตรวจจับกรดนิวคลีอิกของ SARS-CoV-2 จาก Yeasen

ในส่วนของการอ่าน:

การคัดเลือกทรานสคริปเทสย้อนกลับ

Yeasen UDG ที่ไม่เสถียรต่อความร้อน——ควบคุมมลพิษในละอองลอยได้อย่างง่ายดาย

สารยับยั้ง RNase ในหนู - กำจัดการปนเปื้อนของ RNase และรักษา RNA ได้สำเร็จ