PCR (Polymerase Chain Reaction) เป็นเทคนิคพื้นฐานในชีววิทยาโมเลกุล ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการโคลนยีน การทดสอบการวินิจฉัย และการวิจัย แม้ว่าจะรวดเร็ว มีประสิทธิภาพ และมีความเฉพาะเจาะจงสูง แต่แม้แต่ผู้วิจัยที่มีประสบการณ์ก็ยังอาจพบกับปัญหาเล็กๆ น้อยๆ ที่อาจส่งผลต่อผลการทดลองได้ เพื่อช่วยคุณแก้ไขปัญหาและเพิ่มประสิทธิภาพการทดลอง PCR ของคุณ เราได้จัดทำคู่มือฟรีเล่มนี้ซึ่งประกอบด้วยเคล็ดลับสำคัญ 5 ประการที่คุณอาจไม่เคยพิจารณามาก่อน การปรับแต่งรายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ เหล่านี้จะทำให้คุณเห็นผลลัพธ์ที่ดีขึ้น ผลผลิตที่เพิ่มขึ้น และการขยายแบบไม่จำเพาะเจาะจงน้อยลง
หลักการ PCR
ทำความเข้าใจ PCR: พื้นฐาน
แก่นแท้ของ PCR ขยายส่วน DNA เฉพาะโดยทำซ้ำขั้นตอนที่ควบคุมด้วยอุณหภูมิดังต่อไปนี้: การเปลี่ยนสภาพ การอบอ่อน และการขยายเอนไซม์โพลีเมอเรสของดีเอ็นเอจะสังเคราะห์สายดีเอ็นเอใหม่ ทำให้ปริมาณดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ เมื่อครบจำนวนรอบที่เพียงพอแล้ว ก็จะสามารถตรวจจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอเป้าหมายของคุณได้
ผลผลิต PCR โดยทั่วไปจะเป็นไปตามเส้นโค้งการเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล โดยที่ DNA จะเพิ่มเป็นสองเท่าในแต่ละรอบจนกระทั่งถึงช่วงคงที่ สูตร PCR มาตรฐานคือ:
ผลผลิตของผลิตภัณฑ์ PCR = 2^N สำเนา (โดยที่ N คือจำนวนรอบ)
อย่างไรก็ตาม เมื่อวงจรเพิ่มขึ้น รีเอเจนต์เช่น Taq polymerase, dNTPs และไพรเมอร์ ถูกบริโภคและผลิตภัณฑ์เสริมอาจสะสมจนถึงจุดอิ่มตัว
กราฟขยาย PCR
การทำความเข้าใจและเพิ่มประสิทธิภาพเส้นโค้งนี้ถือเป็นกุญแจสำคัญในการบรรลุผลลัพธ์ PCR คุณภาพสูง
1.การปรับแต่ง สภาวะการปั่นจักรยาน PCR ของคุณ
หนึ่งในขั้นตอนที่สำคัญที่สุดในการปรับ PCR ให้เหมาะสมคือการปรับพารามิเตอร์การหมุนเวียนของคุณ
หลุมพราง #1: มีรอบน้อยเกินไป
หากคุณไม่ได้รันรอบการทำงานเพียงพอ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีความเข้มข้นของเทมเพลตต่ำ DNA เป้าหมายของคุณอาจไม่สามารถขยายได้อย่างเพียงพอ โดยทั่วไป แนะนำให้ใช้ 30-40 รอบสำหรับการขยายที่แข็งแรง หากเทมเพลตของคุณมีปริมาณน้อย อย่ากลัวที่จะเลือกปริมาณที่สูงกว่าในช่วงนี้
หลุมพราง #2: มีรอบมากเกินไป
แม้ว่าการเพิ่มจำนวนรอบการผลิตเพื่อเพิ่มผลผลิตอาจดูน่าดึงดูด แต่การเพิ่มรอบมากเกินไปอาจทำให้เกิดการขยายแบบไม่จำเพาะและผลบวกปลอม ปฏิกิริยานี้มักจะถึงผลผลิตสูงสุดหลังจาก 25-35 รอบ หลังจากนั้นจะเข้าสู่ระยะคงที่ซึ่งผลิตภัณฑ์จะไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ
เคล็ดลับ:เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ ให้ใช้รีเอเจนต์ PCR ประสิทธิภาพสูง เช่น มาสเตอร์มิกซ์ Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR (Cat# 10167ES) ซึ่งสามารถลดภาวะการหยุดนิ่งของปฏิกิริยาและให้ผลผลิตสูงภายในเพียง 30-35 รอบเท่านั้น
รูปที่ 1: 10167 ขยายโคโลนี E. coli ขนาด 576 bp โดยใช้แหล่งยีนจาก Arabidopsis thaliana ซึ่งมีประสิทธิภาพเหนือกว่าผลิตภัณฑ์ของคู่แข่ง เวลาในการขยายพันธุ์คือ 30 วินาที/กิโลเบส และขยายพันธุ์ด้วย 34 รอบ
2.ปรับปรุงการออกแบบไพรเมอร์ของคุณให้สมบูรณ์แบบ
การออกแบบไพรเมอร์ถือเป็นรากฐานของการทดลอง PCR และข้อผิดพลาดเล็กๆ น้อยๆ ที่นี่สามารถทำลายปฏิกิริยาทั้งหมดของคุณได้
หลุมพราง #1: การละเลยองค์ประกอบปลาย 3'
ในขณะที่นักวิจัยหลายคนให้ความสำคัญกับเนื้อหาของ GC และความยาวของไพรเมอร์ ไพรเมอร์ที่มีปลาย 3' ถือเป็นปัจจัยสำคัญที่ควรพิจารณา โดยหลักการแล้ว ไพรเมอร์เบสสุดท้ายสองสามเบสควรเป็น G หรือ C เพื่อเพิ่มเสถียรภาพในการยึดเกาะระหว่างไพรเมอร์กับเทมเพลต และลดการไพรเมอร์ผิดประเภทหรือไม่ตรงกัน
หลุมพราง #2: ไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้นไม่ถูกต้อง
หากความเข้มข้นของไพรเมอร์ของคุณสูงเกินไป คุณอาจเสี่ยงต่อการเพิ่มโอกาสของไดเมอร์ไพรเมอร์หรือการจับกันแบบไม่จำเพาะ ในทางกลับกัน หากความเข้มข้นต่ำเกินไป คุณอาจไม่สามารถขยายได้เพียงพอ ความเข้มข้นของไพรเมอร์ขั้นสุดท้ายที่เหมาะสมมักจะอยู่ระหว่าง 0.4 ถึง 0.5 μM
เคล็ดลับ:ยึดมั่นกับความเข้มข้นที่เชื่อถือได้ประมาณ 0.4-0.5 μM สำหรับไพรเมอร์แบบเดินหน้าและถอยหลังตามคำแนะนำของ มาสเตอร์มิกซ์ Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR ชุดอุปกรณ์ ความสม่ำเสมอนี้ช่วยให้เกิดข้อผิดพลาดน้อยลงและได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้มากขึ้น
| ส่วนประกอบ | ปริมาตร (μL) | ปริมาตร (μL) | ความเข้มข้นขั้นสุดท้าย |
| 2×ไฮฟ์ มาสเตอร์มิกซ์ Ultra-Rapid II HotStart PCR- | 25 | 12.5 | 1× |
| เทมเพลต** | เอ็กซ์ | เอ็กซ์ | - |
| ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ เอฟ-10 ไมโครโมลาร์-- | 2 | 1 | 0.4-0.5 ไมโครโมลาร์ |
| รีเวิร์สไพรเมอร์ อาร์ -10 ไมโครโมลาร์- | 2 | 1 | 0.4-0.5 ไมโครโมลาร์ |
| ดีดีเอช2โอ้ | สูงถึง 50 | สูงถึง 25 | - |
3. คำนึงถึงคุณภาพและปริมาณของเทมเพลต DNA
เทมเพลต DNA มีบทบาทสำคัญในปฏิกิริยา PCR ของคุณ และปัญหาเกี่ยวกับคุณภาพหรือความเข้มข้นอาจนำไปสู่การขยายที่ไม่ดี
กับดัก #1: การย่อยสลาย DNA ของเทมเพลต
DNA อาจเสื่อมสภาพลงตามกาลเวลา โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อไม่ได้จัดเก็บอย่างถูกต้อง ตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณได้ทดสอบความเข้มข้นของเทมเพลตเป็นประจำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากเทมเพลตถูกจัดเก็บเป็นเวลานานควรตรวจสอบปริมาณ DNA ใหม่เสมอ ก่อนที่จะเริ่มการทดลองของคุณ เพื่อให้แน่ใจว่าจะได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำ
ข้อผิดพลาด #2: เทคนิคการจัดการเทมเพลตที่ไม่เหมาะสม
สำหรับจุลินทรีย์บางชนิด เช่น ยีสต์ การเตรียมเทมเพลตอาจเป็นตัวเปลี่ยนเกมได้ ตัวอย่างเช่น เมื่อทำงานกับยีสต์ การต้มเซลล์เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C เป็นเวลา 3 นาทีก่อนละลาย สามารถเพิ่มผลผลิต PCR ได้อย่างมาก
10167ES การขยายพันธุ์ยีสต์
เคล็ดลับ:ใช้เทมเพลตดีเอ็นเอที่เตรียมสดใหม่และมีการวัดปริมาณอย่างเหมาะสมเสมอ หากคุณกำลังทำงานกับเทมเพลตที่ยากกว่า (เช่น ยีสต์) ให้พิจารณาปรับแต่งโปรโตคอลการสกัดเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น
4. หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนในสารเคมีของคุณ
การปนเปื้อนในรีเอเจนต์ของคุณมักเป็นสาเหตุที่ทำให้ PCR ล้มเหลว ซึ่งรวมถึงการปนเปื้อนทางกายภาพจากปิเปตและการปนเปื้อนข้ามระหว่างรีเอเจนต์ของคุณ
หลุมพราง #1: การปนเปื้อนข้ามของสารเคมี
รีเอเจนต์ PCR เช่นไพรเมอร์ มักถูกแช่แข็งและละลายหลายครั้ง ซึ่งอาจเพิ่มความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนได้ จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องเติมไพรเมอร์เป็นส่วนประกอบสุดท้ายในปฏิกิริยาเพื่อลดความเสี่ยงนี้
ข้อผิดพลาด #2: การขยายสัญญาณแบบไม่เฉพาะเจาะจง
หากไม่เติมไพรเมอร์ในลำดับที่ถูกต้อง หรือไม่เปลี่ยนปลายปิเปตระหว่างขั้นตอนต่างๆ อาจเกิดการปนเปื้อนข้ามกันระหว่างปฏิกิริยา ส่งผลให้การขยายตัวไม่จำเพาะ
เคล็ดลับ:ปฏิบัติตามลำดับการเติมสารเคมีที่เหมาะสม: น้ำ → ไพรเมอร์ → เทมเพลต → เอนไซม์ PCR Mix วิธีนี้จะช่วยหลีกเลี่ยงปัญหาการปนเปื้อนและทำให้ปฏิกิริยาของคุณสะอาดและเชื่อถือได้
5. เลือกส่วนผสม PCR และสารเติมแต่งที่เหมาะสม
การผสม PCR ไม่ได้ถูกสร้างมาเท่าเทียมกันทั้งหมด การเลือกส่วนผสมที่ถูกต้องจะสามารถสร้างความแตกต่างให้กับความสำเร็จของการทดลองของคุณได้
ข้อผิดพลาด #1: การใช้ส่วนผสม PCR ที่ด้อยคุณภาพ
ส่วนผสม PCR บางชนิดมีประสิทธิภาพน้อยกว่าในการจัดการเทมเพลตที่ซับซ้อนหรือเนื้อหา GC สูง สำหรับปฏิกิริยาที่ท้าทาย พิจารณาใช้ส่วนผสมประสิทธิภาพสูงที่ออกแบบมาเพื่อการขยายอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ
เคล็ดลับ:เราแนะนำให้ใช้ Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR มาสเตอร์มิกซ์ (Cat# 10167ES)ซึ่งให้เวลาในการขยายที่เร็วขึ้นและประสิทธิภาพที่ดีขึ้นกับเทมเพลตที่ยาก ความสามารถในการจัดการเนื้อหา GC สูงและชิ้นส่วนขนาดใหญ่ไม่มีใครเทียบได้ ช่วยให้คุณได้รับผลตอบแทนที่สูงขึ้นในช่วงเวลาที่สั้นลง
การสาธิตประสิทธิภาพ
- การขยายพันธุ์อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ
รูปที่ 1: การทดสอบการขยายเวลาการขยายแบบสุดขั้วสำหรับโคโลนี E. coli สำหรับชิ้นส่วนที่มีขนาดภายใน 3 kb 10167ES มีประสิทธิภาพในการขยาย 1 วินาที/kbสำหรับชิ้นส่วนขนาด 6 กิโลเบส ประสิทธิภาพการขยายคือ 3 วินาทีต่อกิโลเบส และสำหรับชิ้นส่วนขนาด 6-10 กิโลเบส ประสิทธิภาพจะถึง 5 วินาทีต่อกิโลเบส M: เครื่องหมาย DNA 10,000 ตัว (10505ES)
- การขยายขนาดอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพของชิ้นส่วนยาวและของเหลวแบคทีเรีย GC สูง
รูปที่ 2: การขยายขนาดชิ้นส่วนยาวและของเหลวแบคทีเรีย GC สูงแสดงให้เห็นว่า 10167ES ให้ปริมาณที่สูงกว่าด้วยอัตราการตรวจจับ 100% ซึ่งเหนือกว่าผลิตภัณฑ์ของคู่แข่งM: 10,000 DNA Marker (10505ES) ความเร็วในการขยายของ 10167ES คือ 10 วินาที/กิโลบิตต่อวินาที ในขณะที่ผลิตภัณฑ์ของคู่แข่งใช้เวลา 15 วินาที/กิโลบิตต่อวินาที
บทสรุป: รายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ แต่สร้างผลกระทบใหญ่หลวง
การปรับปรุง PCR ไม่ใช่แค่การปฏิบัติตามขั้นตอนตามโปรโตคอลเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการทำความเข้าใจว่าการเปลี่ยนแปลงเล็กๆ น้อยๆ สามารถปรับปรุงผลลัพธ์ของคุณได้อย่างไร ตั้งแต่การปรับสภาพวงจรไปจนถึงการรับประกันคุณภาพของรีเอเจนต์ การใส่ใจในรายละเอียดเหล่านี้สามารถสร้างหรือทำลายการทดลอง PCR ของคุณได้
โดยใช้เวลาในการเพิ่มประสิทธิภาพโปรโตคอลของคุณและใช้สารเคมีที่ถูกต้อง เช่น มาสเตอร์มิกซ์ Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCRคุณสามารถเพิ่มประสิทธิภาพและผลลัพธ์ของ PCR ได้อย่างมาก โปรดจำไว้ว่าในโลกแห่ง PCR รายละเอียดนั้นสำคัญ
พร้อมที่จะปรับปรุงผล PCR ของคุณหรือยัง สำรวจผลิตภัณฑ์ของเราได้แล้ววันนี้ แล้วปล่อยให้ ไฮเอฟ® อุลตร้า-มาสเตอร์มิกซ์ Rapid II HotStart PCR ยกระดับการวิจัยของคุณสู่ระดับต่อไป!
เกี่ยวกับ Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
PCR มิกซ์รุ่นใหม่นี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อการขยายพันธุ์ที่รวดเร็ว มีประสิทธิภาพ และให้ผลผลิตสูง ไม่ว่าคุณจะทำงานกับกลุ่มแบคทีเรีย เทมเพลตที่ยาก หรือเนื้อหา GC สูง มิกซ์นี้จะช่วยให้คุณได้รับผลลัพธ์ที่ดีที่สุดด้วยเวลาที่น้อยลงและรอบการทำงานน้อยลง
เวอร์ชันอัพเกรดของ Fast PCR Master Mix
2×ไฮฟ์ มาสเตอร์มิกซ์ Ultra-Rapid II HotStart PCR
รวดเร็ว มีประสิทธิภาพ หยุดภาวะซบเซา และเพิ่มผลผลิต
| การวางตำแหน่งผลิตภัณฑ์ | ชื่อ | หมายเลขแคตตาล็อก | ข้อมูลจำเพาะ |
| อัพเกรด PCR ที่รวดเร็ว เหมาะสำหรับ PCR แบคทีเรียและการขยายเทมเพลตที่ซับซ้อน | มาสเตอร์มิกซ์ 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR | 1 มล./5×1 มล. | |
| โคลนนิ่งขั้นตอนเดียวที่เร็วที่สุดใน 5 นาทีสำหรับชิ้นส่วน 1-7 ชิ้น | ชุดโคลนนิ่ง Hieff Clone® Universal II ขั้นตอนเดียว | 20 ตัน/50 ตัน |
หากต้องการข้อมูลเพิ่มเติมหรือต้องการซื้อ โปรดเยี่ยมชม เว็บไซต์อย่างเป็นทางการ-