บทที่ 1: เทคโนโลยี PCR
1.1 หลักการของ PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) หรือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส หมายถึง DNA โพลีเมอเรส เร่งปฏิกิริยาโดยสาย DNA ของแม่เป็นแม่แบบด้วย ไพรเมอร์เฉพาะ สำหรับการขยายจุดเริ่มต้นให้เพิ่ม dNTP, Mg2+ และ ปัจจัยขยาย, การเพิ่มประสิทธิภาพการขยาย ปัจจัย- ผ่านขั้นตอนการเปลี่ยนสภาพ การอบ และการขยาย การจำลองสายลูกในหลอดทดลองเป็นส่วนเสริมของดีเอ็นเอแม่แบบของสายแม่ ซึ่งสามารถขยายดีเอ็นเอเป้าหมายใดๆ ได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจงในหลอดทดลอง
1.2 การจำแนกประเภทของดีเอ็นเอโพลีเมอเรส
ดีเอ็นเอโพลเป็น เอนไซม์ที่สำคัญสำหรับ เซลลูล่าร์ การจำลองดีเอ็นเอ โดยพิจารณาจากเสถียรภาพทางความร้อน ความสามารถในการสังเคราะห์ ความเร็ว ความเที่ยงตรง และ ความเฉพาะเจาะจงสามารถจำแนกได้เป็น Taq DNA polymerase, high-fidelity DNA polymerase, hot-start DNA polymerase, direct-expansion DNA polymerase, long-fragmented DNA polymerase เอนไซม์, DNA โพลิเมอเรสแบบเร็ว, DNA โพลิเมอเรสหลายตัว และอื่นๆ-
ที่พบมากที่สุดคือ Taq DNA polymerase ซึ่งมีกิจกรรมของพอลิเมอเรสที่ปลาย 5'→3' และ กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส ที่ปลาย 5'→3'แต่ไม่มี กิจกรรมแก้ไขปลาย 3'→5' คุณสมบัติที่สำคัญที่สุดของ Taq คือการทนความร้อนได้ดี ซึ่งสามารถทนต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพเนื่องจากความร้อนได้ ก้าว ของพีซีอาร์ทำให้ไม่จำเป็นต้องเพิ่มเอนไซม์เพิ่มเติมในระหว่างกระบวนการ อย่างไรก็ตาม Taq มีความแม่นยำต่ำเนื่องจากไม่มีการตรวจสอบความถูกต้อง ส่วนใหญ่ทำได้โดยความเข้มข้นและอัตราส่วนของไอออนแมกนีเซียมและ dNTPs
ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสที่มีความเที่ยงตรงสูงประกอบด้วยศูนย์โพลีเมอไรเซชันและศูนย์แยกส่วน ศูนย์โพลีเมอไรเซชันมีกิจกรรมดีเอ็นเอโพลีเมอเรส 5'→3' ซึ่งสามารถเร่งปฏิกิริยาได้ การสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ตามทิศทาง 5'→3'; ศูนย์กลางการแยกมีกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 3'→5' ซึ่งสามารถดำเนินการซ่อมแซมความไม่ตรงกันของเบสได้ ดังนั้น นอกเหนือจากลักษณะของโพลีเมอเรส Taq DNA แล้ว โพลีเมอเรส DNA ที่มีความเที่ยงตรงสูงยังมีกิจกรรมการแก้ไขที่รับผิดชอบ การตัดออก ความไม่ตรงกัน นิวคลีโอไทด์จึงทำให้มั่นใจถึงความแม่นยำของผลิตภัณฑ์-
แผนภาพด้านบนแสดงให้เห็นวิธีการทำงานของดีเอ็นเอโพลีเมอเรส [1]-
ไดเร็กต์พีซีอาร์ (Direct PCR) คือ ปฏิกิริยาที่ ใช้ตัวอย่างที่ไม่บริสุทธิ์สำหรับการขยาย PCR และสัตว์ หรือเนื้อเยื่อพืชเพื่อการขยายโดยตรง. ตอนนี้,
ภาพด้านบนแสดงเทคนิค Direct PCR
ก. วิธีตรง: นำตัวอย่างปริมาณเล็กน้อยแล้วเติมลงใน PCR โดยตรง มาสเตอร์มิกซ์สำหรับการระบุ PCR
B. วิธีการไลซิส: หลังจากเก็บตัวอย่างแล้ว ให้เติมตัวอย่างดังกล่าวลงในสารละลายไลซิสเพื่อปลดปล่อยจีโนม นำของเหลวส่วนบนจากการไลซิสจำนวนเล็กน้อยมาเติมลงใน PCR Master Mix เพื่อระบุด้วย PCR
1.3 คำถามที่พบบ่อยและวิธีแก้ไข
| ปัญหา | เหตุผล | สารละลาย |
| โดยไม่มีแบนด์ขยาย | ปัญหาของระบบอิเล็กโทรโฟเรซิส | แก้ไขปัญหาสีย้อมกรดนิวคลีอิก ความเข้มข้นของเจล และบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิส |
| อุณหภูมิการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างไม่แม่นยำ | อุณหภูมิที่ระบุของเครื่อง PCR สอดคล้องกับอุณหภูมิจริงหรือไม่ หากอุณหภูมิสูงเกินไป เอนไซม์จะถูกย่อยสลายอย่างรวดเร็ว ในรอบแรกๆ ถ้าต่ำเกินไป การทำลายเทมเพลตจะไม่สมบูรณ์ | |
| การปนเปื้อนของโปรตีเอสและนิวคลีเอสในระบบปฏิกิริยา | ควรให้ความร้อนระบบปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5-10 นาที ก่อนที่จะเติมเอนไซม์ Taq | |
| พีข้อผิดพลาดของริมเมอร์ | ตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์หรือออกแบบไพรเมอร์ใหม่โดยใช้ BLAST | |
| เทมเพลตมีสิ่งเจือปน | โดยเฉพาะเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์และฝังด้วยพาราฟินมักมีกรดฟอร์มิก ซึ่งทำให้เกิดภาวะสูญเสียความบริสุทธิ์ของ DNA และส่งผลต่อผล PCR | |
| การเสื่อมสภาพและล้มเหลวของไพรเมอร์ | ยืนยันว่าไพรเมอร์สังเคราะห์ถูกต้อง ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ หรือถูกทำให้ไม่ทำงานเนื่องจากสภาวะการจัดเก็บที่ไม่เหมาะสม | |
| ปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR น้อยลง | อุณหภูมิการอบที่ไม่เหมาะสม | ปฏิกิริยา PCR แบบไล่ระดับได้รับการออกแบบเพื่อปรับอุณหภูมิการอบให้เหมาะสมด้วยการไล่ระดับ 2 องศา |
| การปรากฏตัวของสารยับยั้งในเทมเพลต DNA | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเทมเพลต DNA นั้นสะอาด | |
| การเปลี่ยนสภาพเป็นเวลานาน | การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเป็นเวลานานทำให้ DNA โพลิเมอเรสไม่ทำงาน | |
| ส่วนขยายสั้นเกินไป | ระยะเวลาขยายสั้นเกินไป ตั้งค่าระยะเวลาขยายตามหลักการ 1kb/นาที | |
| จำนวนเทมเพลต DNA ต่ำเกินไป | เพิ่มปริมาณเทมเพลต DNA | |
| ปริมาณไพรเมอร์ไม่เพียงพอ | เพิ่มปริมาณไพรเมอร์ในระบบ | |
| จำนวนรอบ PCR ไม่เพียงพอ | เพิ่มจำนวนรอบปฏิกิริยา | |
| หลายแบนด์ | ไพรเมอร์มีความจำเพาะต่ำ | ซอฟต์แวร์ออกแบบไพรเมอร์ เช่น BLAST และ Primer ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์หรือออกแบบไพรเมอร์ใหม่ |
| จำนวนลูปมากเกินไป | เพิ่มจำนวนเทมเพลตให้เหมาะสม และลดจำนวนรอบ | |
| การปนเปื้อนของ DNA จากภายนอก | มั่นใจการทำงานได้อย่างสะอาด | |
| จำนวนเทมเพลตมากเกินไป | ปริมาณพลาสมิด DNA ควร < 50ng ในขณะที่ DNA ของจีโนมควร < 200ng | |
| ไพรเมอร์มากเกินไป | ลดปริมาณไพรเมอร์ในระบบปฏิกิริยา | |
| สารละลายปฏิกิริยาไม่เข้ากันดี | ตรวจสอบให้แน่ใจว่าบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาละลายหมดและผสมเข้ากันอย่างทั่วถึง | |
| แมกนีเซียม ความเข้มข้นสูง | ปรับความเข้มข้นของ Mg ที่ใช้ให้เหมาะสม | |
| ปริมาณเอนไซม์สูงหรือคุณภาพเอนไซม์ไม่ดี | ลดปริมาณเอนไซม์ลงหรือทดแทนด้วยแหล่งอื่น | |
| อุณหภูมิการอบอ่อนต่ำ การอบอ่อนและระยะเวลาการยืดขยายยาวนาน | เพิ่มอุณหภูมิการอบเพื่อลดเวลาในการเปลี่ยนสภาพและการยืดออก หรือออกแบบปฏิกิริยา PCR แบบไล่ระดับเพื่อปรับอุณหภูมิการอบให้เหมาะสมที่สุด | |
| ปัญหาที่เกิดขึ้นกับการผสม PCR เอง | หากเป็น PCR Premix อาจจะเป็นเรื่องคุณภาพของน้ำยาเอง แนะนำให้เปลี่ยนล็อตหรือยี่ห้ออื่นครับ | |
| ขนาดไม่ถูกต้อง | ซีการปนเปื้อน | ทำความสะอาดม้านั่งด้วยสารเคมีและหัวฉีดใหม่ |
| การใช้เทมเพลตหรือไพรเมอร์อย่างไม่ถูกต้อง | เปลี่ยนไพรเมอร์และเทมเพลต | |
| จีเอโนไทป์ | การวิเคราะห์ลำดับและการศึกษา BLAST ถูกดำเนินการกับยีนที่ศึกษา |
บทที่ 2: การวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกด้วยไฟฟ้า
2.1 หลักการของการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกด้วยไฟฟ้า
การเคลื่อนที่ของอนุภาคที่มีประจุภายใต้การกระทำของสนามไฟฟ้าไปยังอิเล็กโทรดที่ตรงข้ามกับคุณสมบัติทางไฟฟ้าของอนุภาค เรียกว่า อิเล็กโทรโฟเรซิส โดยใช้อนุภาคที่มีประจุในสนามไฟฟ้า เคลื่อนที่ด้วยความเร็วที่แตกต่างกันและบรรลุการแยกเทคโนโลยีที่เรียกว่าอิเล็กโทรโฟเรซิส อิเล็กโทรโฟเรซิสกรดนิวคลีอิกเป็น เครื่องมือที่สำคัญ เพื่อการวิจัยกรดนิวคลีอิก และเป็น ส่วนประกอบที่สำคัญของเทคนิคต่างๆ เช่น โพรบกรดนิวคลีอิก การขยายกรดนิวคลีอิก และการวิเคราะห์ลำดับ การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟเรซิสกรดนิวคลีอิกมักจะเป็น ดำเนินการแล้ว ในอะกาโรสหรือ เจลโพลีอะคริลาไมด์ที่มีความเข้มข้นต่างกัน อะกาโรสและโพลีอะคริลาไมด์สามารถสร้างเจลที่มีขนาดตาข่ายตะแกรงโมเลกุลต่างกันได้ ซึ่งสามารถนำไปใช้แยกชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่างกันได้
2.2 การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเจลอะกาโรส
อะกาโรสเป็นพอลิเมอร์เชิงเส้นที่สกัดจากสาหร่าย อะกาโรสจะถูกให้ความร้อนในสารละลายบัฟเฟอร์แล้วละลายเป็นสารละลายใสโปร่งแสง จากนั้นจึงเทลงไป ลงในแม่พิมพ์เจลาตินและแข็งตัวจนกลายเป็นเมทริกซ์แข็งที่เรียกว่าเจล ซึ่งความหนาแน่นขึ้นอยู่กับ ความเข้มข้นของอะกาโรส
อะกาโรส เจลอิเล็กโทรโฟเรซิสเป็นวิธีอิเล็กโทรโฟเรซิสชนิดหนึ่งที่ใช้อะกาโรสเป็นตัวกลางสนับสนุน และ ความแตกต่างหลักระหว่าง วิเคราะห์ หลักการและการสนับสนุนอื่น ๆ ของอิเล็กโทรโฟเรซิสก็คือมันมี บทบาทคู่ ของ “ตะแกรงโมเลกุล” และ “อิเล็กโตรโฟเรซิส” เจลวางอยู่ใน สนามไฟฟ้า, ภายใต้ การกระทำของ สนามไฟฟ้าประจุไฟฟ้า กรดนิวคลีอิกอพยพไปที่ เชิงบวก เสา ผ่าน ตาข่าย ของ เดอะ เจล. การ อัตราการ การอพยพได้รับผลกระทบจากขนาดของ โมเลกุลกรดนิวคลีอิก, ความเข้มข้นของอะกาโรส, แรงดันไฟฟ้าที่ใช้, สนามไฟฟ้า, บัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิส และปริมาณของสีย้อมที่ฝังอยู่ หลังจากผ่านเวลาที่เหมาะสมในการทำอิเล็กโตรโฟร์สเป็น ภายใต้ เงื่อนไขที่แตกต่างกันชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกที่มีขนาดและโครงสร้างต่างกันจะอยู่ในตำแหน่งต่างกันบนเจล ดังนั้นจึงบรรลุวัตถุประสงค์ของการแยกการแยกเจลอะกาโรส มีขอบเขตกว้าง นิยมใช้ในการกู้คืนเจลตัด DNA การแยก DNA และใช้เพื่อสนับสนุนว่า DNA นั้นเป็นแบบรีคอมบิแนนท์หรือไม่ พลาสมิด ฯลฯ ไม่ว่าจะตัดพลาสมิดหรือไม่ก็ตาม ความเข้มข้นของเจลอะกาโรสต่างกัน สามารถแยกได้จากความยาวของ 200bp ถึง 50กิโลไบต์ ของ ดีเอ็นเอ ชิ้นส่วนต่างๆ
2.3 วิธีการทดลอง
การทำ กาว
ยกตัวอย่างความเข้มข้น 1%: ชั่งอะกาโรส 1 กรัม เทลงในขวดกรวยขนาด 250 มล. เติมบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิส 0.5×TBE 100 มล. และผสมให้เข้ากันแล้วนำไปต้มในไมโครเวฟ ปล่อยให้แห้งด้วยอากาศประมาณ 60℃ เติมสีย้อมกรดนิวคลีอิกในปริมาณที่เหมาะสมแล้วเขย่าให้เข้ากัน จากนั้นเทลงในแผ่นเจลที่สะอาดที่เตรียมไว้แล้ว ใช้มือทั้งสองข้างหวี ใส่ลงในสารละลายเจลในแนวตั้งแล้วรอ เจลที่จะเป็น ปล่อยให้เย็นลงโดยธรรมชาติจนกระทั่งแข็งตัวสมบูรณ์ (25-30 นาที)
ถอดหวีทำกาวออก
ถ่ายโอนเจลอย่างระมัดระวังไปยังถังอิเล็กโทรโฟเรซิส (โดยใช้ถาดเจลหรือเจลเพียงอย่างเดียว- วางด้านบ่อตัวอย่างไว้ที่ขั้วลบ และเติม 0.5× TBE บัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟเรซิสจนกระทั่งเจลอยู่ต่ำกว่าประมาณ 1 มม.
เพิ่ม ตัวอย่าง
เพิ่มบัฟเฟอร์โหลด 10× (โหลด บัฟเฟอร์- สู่ตัวอย่างดีเอ็นเอ- ผสมให้เข้ากัน จากนั้นค่อยๆ เติมส่วนผสมตัวอย่างลงในภาชนะบีเจลผสาน บ่อน้ำ ด้วยปืนยิงปิเปตโดยเติมตัวอย่าง 5-10 μL ต่อหลุม (ไม่เกิน 40 μL) โดยทั่วไป หลุมแรกควรเติมด้วยเครื่องหมาย DNA ส่วนหลุมที่สองควรเติมตัวควบคุมเชิงบวก (กำหนด DNA), และ ที่สามด้วยการควบคุมเชิงลบ (สารเคมีหรือน้ำ), และ ควรบันทึกลำดับตัวอย่าง
การวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟเรซิส
ครอบคลุม ถังอิเล็กโตรโฟเรซิสเชื่อมต่อ สายไฟเปิดเครื่องและตั้งค่าแรงดันไฟ กระแสไฟ และเวลา พารามิเตอร์ โดยทั่วไปแล้ว แรงดันไฟฟ้าไม่ควรเกิน 5 v/cm (ความยาวหมายถึง ระยะห่างระหว่างขั้วบวกและขั้วลบของถังอิเล็กโทรโฟเรซิส), และ เวลาอิเล็กโทรโฟเรซิสโดยทั่วไป 15-30นาที
สิ้นสุดกระบวนการอิเล็กโตรโฟเรซิส
ลบ เดอะ เจล (ไม่มีถาดเจล) แล้วถ่ายภาพภายใต้ระบบถ่ายภาพ UV เพื่อให้ได้ภาพอิเล็กโทรโฟเรติกที่ชัดเจน จากนั้นแก้ไขภาพอิเล็กโทรโฟเรติก ด้วยซอฟต์แวร์แก้ไขรูปภาพและ ติดฉลากด้วยข้อมูลตัวอย่าง วันที่ และผู้ปฏิบัติงาน
2.4 คำถามที่พบบ่อยและวิธีแก้ไข
| ปัญหา | เหตุผล | สารละลาย |
| แถบเป้าหมายหายไป | DNA ขนาดเล็กหมดจากเจล | ลดระยะเวลาการวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้า ลดแรงดันไฟฟ้า เพิ่มความเข้มข้นของเจล |
| แถบ DNA ที่มีขนาดมวลโมเลกุลใกล้เคียงกันนั้นไม่สามารถแยกแยะได้ง่าย | เพิ่มเวลาการวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้าให้ตรงกับความเข้มข้นของเจลที่เหมาะสมที่สุด | |
| ชิ้นส่วนเป้าหมายมีขนาดใหญ่เกินไปสำหรับการวิเคราะห์ด้วยไฟฟ้าแบบธรรมดา | วิเคราะห์โดยใช้เทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบพัลส์ | |
| คลิปไม่มีจุดประสงค์ | กระบวนการ PCR มีข้อบกพร่องและไม่ได้ขยายผลิตภัณฑ์เป้าหมาย | |
| แถบ DNA เบลอ | บัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟเรซิสเก่า | เมื่อใช้บัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิสหลายครั้ง ความเข้มข้นของไอออนจะลดลง ค่า pH จะเพิ่มขึ้นอย่างช้าๆ และความสามารถในการชะล้างจะลดลง ส่งผลให้ผลของอิเล็กโทรโฟเรซิสลดลง ดังนั้นจึงขอแนะนำให้เปลี่ยนบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิสบ่อยๆ |
| การย่อยสลายของดีเอ็นเอ | หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของนิวคลีเอส | |
| เงื่อนไขอิเล็กโทรโฟเรซิสที่ใช้ไม่เหมาะสมสำหรับอิเล็กโทรโฟเรซิส | แรงดันไฟฟ้าอิเล็กโทรโฟเรซิสไม่ควรเกิน 20V/cm และอุณหภูมิควร <30°C; อุณหภูมิของอิเล็กโทรโฟเรซิสของสาย DNA ขนาดใหญ่ควร <15°C; ตรวจสอบว่าบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิสที่ใช้มีความสามารถในการบัฟเฟอร์เพียงพอหรือไม่ | |
| การสุ่มตัวอย่างดีเอ็นเอมากเกินไป | ลดปริมาณ DNA ที่ถูกสุ่มตัวอย่างในเจล | |
| ตัวอย่าง DNA เค็มเกินไป | เกลือส่วนเกินจะถูกกำจัดออกด้วยการตกตะกอนเอธานอลก่อนการทำอิเล็กโทรโฟเรซิส | |
| การปนเปื้อนของโปรตีน | การสกัดฟีนอลก่อนอิเล็กโตรโฟเรซิสจะกำจัดโปรตีนออกไป | |
| ความเข้มข้นของตัวอย่างสูงเกินไป | ความเข้มข้นของตัวอย่างด้านบนควรน้อยกว่า 500ng/หลุม ความเข้มข้นที่สูงเกินไปจะส่งผลต่อความเร็วของอิเล็กโทรโฟเรซิส การทำงาน ส่งผลให้เกิดการลากและภาพเบลอ | |
| แบนด์อ่อนหรือไม่มีเลย | ขนาดตัวอย่างของ DNA ไม่เพียงพอ | เพิ่มปริมาณการดูดซึม DNA |
| การย่อยสลายของดีเอ็นเอ | การหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของนิวคลีเอสในดีเอ็นเอ | |
| แหล่งกำเนิดแสงที่ไม่เหมาะสมสำหรับสีย้อมกรดนิวคลีอิก | เลือกแหล่งกำเนิดแสงที่มีความยาวคลื่นที่เหมาะสมตามคำแนะนำสำหรับสีย้อมกรดนิวคลีอิก | |
| แบนด์ไม่แยก | ขาดเวลา | เพิ่มเวลาอิเล็กโทรโฟเรซิส |
| ความเข้มข้นของเจลไม่ถูกต้อง | ความเข้มข้นของกาวสูงเกินไป ส่งผลให้มีความต้านทานต่อการแยกตัวมากเกินไป | |
| ความเข้มข้นของไอออนเกลือในตัวอย่างสูงเกินไป | ความเข้มข้นสูงของไอออนเกลือจะเพิ่มความต้านทานต่ออิเล็กโทรโฟเรซิสและป้องกันการแยกแถบ เช่น ตัวอย่างที่ย่อยแล้วที่มีบัฟเฟอร์เอนโดนิวคลีเอส | |
| แบนด์ไม่เฉพาะเจาะจง | การปนเปื้อนของ RNA | การเตรียมตัวอย่างใหม่ |
| การปนเปื้อนระหว่างตัวอย่าง | การเปลี่ยนปลายระหว่างการบรรจุ หลีกเลี่ยงการหกของตัวอย่างที่มีปริมาตร >40 μl |
2.5 การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสของเจลโพลีอะคริลาไมด์
เจลโพลีอะคริลาไมด์เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาเคมีระหว่างโมโนเมอร์อะคริลาไมด์ ตัวเร่งปฏิกิริยาการเกิดพอลิเมอไรเซชันแบบโซ่ N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) และแอมโมเนียมเพอร์ซัลเฟต และตัวเชื่อมขวาง N,N'-methylenebisacrylamide โมโนเมอร์อะคริลาไมด์เกิดพอลิเมอไรเซชันในที่ที่มีตัวเร่งปฏิกิริยาเพื่อสร้างสารโพลีเมอร์แบบยาว โซ่ซึ่งเป็น เชื่อมโยงกัน โดย สารเชื่อมขวางเพื่อสร้างเจลซึ่งขนาดรูพรุนนั้นกำหนดโดยความยาวของโซ่และระดับของการเชื่อมขวาง ขนาดรูพรุนนั้นกำหนดโดยความยาวของโซ่และ ระดับของการเชื่อมโยงข้าม ความยาวของโซ่ขึ้นอยู่กับ ความเข้มข้นของอะคริลาไมด์และระดับการเชื่อมโยงขวางของพอลิเมอร์สามารถเปลี่ยนแปลงได้โดยการปรับอัตราส่วนของอะคริลาไมด์ต่อสารเชื่อมโยงขวาง-
การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสด้วยเจลโพลีอะคริลาไมด์สามารถนำมาใช้ได้ แยก ตัวอย่างตาม ความแตกต่างใน ค่าใช้จ่าย, ขนาดโมเลกุลและรูปร่างของ ตัวอย่างที่ผ่านการอิเล็กโทรโฟรีซิส. มันรวมการร่อนโมเลกุลและไฟฟ้าสถิต และมีกำลังแยกที่สูงกว่าอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบเจลอะกาโรส ชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ต่างกันเพียง นิวคลีโอไทด์หนึ่งตัว สามารถแยกออกได้-
การวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสโพลีอะคริลาไมด์ใช้ในการวิเคราะห์และเตรียมชิ้นส่วน DNA ที่มีความยาวน้อยกว่า 1 กิโลเบส ขึ้นอยู่กับ ขนาดของ เศษกรดนิวคลีอิกที่จะแยกออกมา- เจลของ แตกต่าง สามารถเตรียมไว้ได้-
ช่วงการแยกที่มีประสิทธิภาพสำหรับอะคริลาไมด์และ DNA ที่ความเข้มข้นต่างกันแสดงอยู่ในตารางด้านล่าง:
| ความเข้มข้น - | ช่วงการแยกที่มีประสิทธิภาพ (bp) |
| 3.5 | 100 ถึง 2000 |
| 5 | 80 ถึง 500 |
| 8 | 60 ถึง 400 |
| 12 | 40 ถึง 200 |
| 15 | 25 ถึง 150 |
| 20 | 10 ถึง 100 |
2.4. หลักเกณฑ์การเลือกสรรผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้อง
PCR แบบธรรมดา | ||||
| ข้อมูลจำเพาะ | 10167ES | 10102ES | 10103ES | 10108ES |
| ความยาวการขยาย | ≤10-15 กิโลไบต์ | ≤5กิโลไบต์ | ≤5กิโลไบต์ | ≤4กิโลไบต์ |
| ระยะเวลาขยายเวลา | 1-10 วินาที/กิโลไบต์ | 30 วินาที/กิโลไบต์ | 30 วินาที/กิโลไบต์ | 30 วินาที/กิโลไบต์ |
| โครงสร้างปลายผลิตภัณฑ์ | 3'-วันเอ | 3'-วันเอ | 3'-วันเอ | 3'-วันเอ |
| อุณหภูมิการอบ | 60℃ | เทอร์โมมิเตอร์-(2~5)℃ | เทอร์โมมิเตอร์-(2~5)℃ | เทอร์โมมิเตอร์-(2~5)℃ |
| ช่วงความเข้ากันได้ของ GC | 30-70% | 40-70% | 40-70% | 30-70% |
| กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 5'-3' | ปัจจุบัน | ปัจจุบัน | ปัจจุบัน | ปัจจุบัน |
| พีซีอาร์แบบโคโลนี | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม |
| การระบุยีน | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม |
| มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ | ไม่เหมาะสม | ไม่เหมาะสม | ไม่เหมาะสม | 3-4 เพล็กซ์พีซีอาร์ |
| ตัวบ่งชี้อิเล็กโทรโฟเรซิส | สีม่วงแดง | สีฟ้า | ไม่มีสี | สีฟ้า |
| ฮอตสตาร์ต | ฮอตสตาร์ต | สตาร์ทไม่ติด | สตาร์ทไม่ติด | ฮอตสตาร์ต |
| พรีมิกซ์/ชุด | พรีมิกซ์ | พรีมิกซ์ | พรีมิกซ์ | พรีมิกซ์ |
พีซีอาร์โดยตรง | ||||
| ข้อมูลจำเพาะ | 10185ES | 10188ES | 10187ES | |
| ประเภทสินค้า | การขยายสัญญาณโดยตรงของเมาส์ | การขยายเลือดโดยตรง | การขยายพันธุ์พืชโดยตรง | |
| ความยาวการขยาย | ≤1กิโลไบต์ | ≤8กิโลไบต์ | ≤1กิโลไบต์ | |
| ระยะเวลาขยายเวลา | 30 วินาที/กิโลไบต์ | 3-5 s/kb สำหรับ ≤2 kb | 60 วินาที/กิโลไบต์ | |
| 10 s/kb สำหรับ ≤8 kb | ||||
| เวลาการไลซิสตัวอย่าง | 15 นาที | 0-3 นาที | 0-10 นาที | |
| โครงสร้างปลายผลิตภัณฑ์ | ปลายทื่อ | ปลายทื่อ | ปลายทื่อ | |
| อุณหภูมิการอบ | ทีเอ็ม-(2~5)℃ | ทีเอ็ม-(1~2)℃ | ทีเอ็ม-(2~5)℃ | |
| ช่วงความเข้ากันได้ของ GC | 30-70% | 30-75% | 40-65% | |
| กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 5'-3' | ||||
| การระบุยีน | ||||
| มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ | 3-4 เพล็กซ์ | |||
| การขยายตัวอย่างโดยตรง | ||||
| ตัวบ่งชี้อิเล็กโทรโฟเรซิส | สีฟ้า | ไม่มีสี | สีฟ้า | |
| ฮอตสตาร์ต | ||||
| พรีมิกซ์/ชุด | ชุดคิท (พร้อมมิกซ์) | ชุดคิท (พร้อม มิกซ์ + บัฟเฟอร์) | ชุดคิท (พร้อมมิกซ์) | |
| สิ่งมีชีวิตที่เหมาะสม | หนู,หนู | มนุษย์, หนู, แพะ, ไก่, หมู, ฯลฯ. | ข้าว ข้าวโพด ยาสูบ เรพซีด ข้าวสาลี ถั่วเหลือง ฯลฯ | |
| เนื้อเยื่อ/วัสดุที่เหมาะสม | หาง หู นิ้วเท้า (พร้อมกล้ามเนื้อ) และอวัยวะอื่นๆ | เลือดสดที่มี EDTA, เฮปาริน, ซิเตรต ฯลฯ เลือดแช่เย็น (แช่แข็ง) เลือดแห้งเชิงพาณิชย์ | ใบอ่อน ใบแก่ ต้นกล้า ลำต้นอ่อน | |
| ตัวอย่างอินพุต | เนื้อเยื่อ: 5-10 มก.; หาง: 1-5 มม. | เลือดทั้งหมด: 0.5%-20%, จุดเลือดแห้ง: 1 มม.² | ใบ: 1-10 มม., เมล็ด: 1-3 มม. | |
PCR ความเที่ยงตรงสูง | ||||
| ข้อมูลจำเพาะ | 10164ES | 10153ES | 10154ES | |
| ความยาวการขยาย | ≤10 กิโลเบส gDNA, ≤10 กิโลเบส cDNA, ≤16 กิโลเบส λDNA | ≤10 กิโลเบส gDNA, ≤10 กิโลเบส cDNA, ≤13 กิโลเบส λDNA | ≤10 กิโลเบส gDNA, ≤10 กิโลเบส cDNA, ≤13 กิโลเบส λDNA | |
| ระยะเวลาขยายเวลา | 5 วินาที/กิโลไบต์ | 30 วินาที/กิโลไบต์ | 30 วินาที/กิโลไบต์ | |
| ความซื่อสัตย์ (Taq) | 83× | 83× | 83× | |
| โครงสร้างปลายผลิตภัณฑ์ | ปลายทื่อ | ปลายทื่อ | ปลายทื่อ | |
| อุณหภูมิการอบ | 60℃ | 68℃ | 68℃ | |
| ช่วงความเข้ากันได้ของ GC | 20-80% | 30-60% | 30-60% | |
| กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส 5'-3' | ไม่มา | ไม่มา | ไม่มา | |
| ตัวบ่งชี้อิเล็กโทรโฟเรซิส | สีฟ้า | ไม่มีสี | สีฟ้า | |
| เอนไซม์เดี่ยว/พรีมิกซ์ | พรีมิกซ์ | เอนไซม์เดี่ยว | พรีมิกซ์ | |
| ความอดทน | - | - | เลือด เนื้อเยื่อหนู ไลเสท | |
การวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกด้วยไฟฟ้า | ||||
| หมวดหมู่สินค้า | หมายเลขแมว | ชื่อสินค้า | แอปพลิเคชัน | |
| อะกาโรส | 10208ES | อะกาโรส | การวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกแบบปกติ | |
| 10221ES | อะกาโรสร่อนสูง (เกรด PCR) | เหมาะสำหรับการแยกชิ้นส่วน DNA ขนาด 20 bp-800 bp เทียบเท่ากับเจลโพลีอะคริลาไมด์ | ||
| 10226ES | เม็ดยาอะกาโรส (0.5 กรัม/เม็ด) | สะดวกสำหรับการประยุกต์ใช้อะกาโรสเป็นประจำ | ||
| สีย้อมกรดนิวคลีอิก | 10202ES | เจลสเตนกรดนิวคลีอิก YeaRed (10,000× ในน้ำ) | ละลายน้ำได้ มีคุณสมบัติเชิงสเปกตรัมคล้ายกับ EB สามารถกระตุ้นได้ที่แสง UV 300 นาโนเมตร | |
| เครื่องหมายดีเอ็นเอ | 10510ES | บันได DNA GoldBand 1 kb | 250-12000 bp (13 แบนด์) | |
| 10515ES | บันได DNA 50 คู่เบส GoldBand | 50-1000 bp (14 แบนด์) | ||
| 10507ES | บันได DNA 100bp ของ GoldBand | 100-1500 bp (12 แบนด์) | ||
| 10516ES | GoldBand 100 bp พร้อมบันได DNA | 100-3000 bp (14 แบนด์) | ||
| 10517ES | บันไดดีเอ็นเอ GoldBand 200 คู่เบส | 200-5000 bp (12 แบนด์) | ||
| 10518ES | บันไดดีเอ็นเอ GoldBand 500 คู่เบส | 500-5000 bp (8 แบนด์) | ||
| 10501ES | เครื่องหมายดีเอ็นเอ GoldBand DL2000 | 100-2000 bp (6 แบนด์) | ||
| 10504ES | เครื่องหมายดีเอ็นเอ GoldBand DL5000 | 100-5000 bp (9 แบนด์) | ||
| 10505ES | เครื่องหมายดีเอ็นเอ GoldBand DL10,000 | 100-10000 bp (10 แบนด์) | ||
| 10511ES | บันได DNA เต็มรูปแบบของ GoldBand | 100-12000 bp (20 แบนด์) | ||
| 10512ES | เครื่องหมายดีเอ็นเอ GoldBand DL15000 | 250-15000 bp (7 แบนด์) |
2.5 สิ่งพิมพ์ที่ใช้ผลิตภัณฑ์อิเล็กโทรโฟรีซิสกรดนิวคลีอิก (Pงานศิลปะ)
[1] หลัว เจ, หยาง Q, Zhang X และคณะ TFPI คือตัวรับคริปต์ลำไส้ใหญ่สำหรับ TcdB จากกลุ่ม 2 C. difcile ที่มีไวรัสรุนแรงมาก เซลล์. 2022;185(6):980-994. e15. doi:10.1016/j.cell.2022.02.010 (แก้ไข:41.584)
[2] Huang N, Chen H, Gong H และคณะ SeHed ระบบการแสดงออกของยีนแบบใหม่ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกซ์ที่เกิดจากความเครียด คุณสมบัติการกำจัดของเสียและผลต่อต้านวัย การถ่ายทอดสัญญาณและการบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย 2022, 7, 235. doi: 10.1038/s41392-022-01047-2. (ถ้า: 38.1)
[3] Zhang C, Zhou B, Gu F และคณะ การยับยั้ง PACMP ของไมโครเปปไทด์ทำให้เกิดผลร้ายแรงจากการสังเคราะห์ โดยการลด CtIP และโพลี(ADP-ไรโบซิล) ไอออน โมล Cell. 2022;82(7):1297-1312.e8. doi:10.1016/j.molcel.2022.01.020 (IF:17.970)
[4] Zhu M, DaiX การยับยั้งการเจริญเติบโตโดยระดับ (p)ppGpp ที่เปลี่ยนแปลงเป็นผลมาจากระดับที่ไม่เหมาะสม การจัดสรรทรัพยากรใน Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2019;47(9):4684-4693. doi:10.1093/นาร์/gkz211 (IF:11.147)
[5] Rizwan HM, Zhimin L, HarsonowatiW และคณะ การระบุเชื้อก่อโรคเชื้อราเพื่อควบคุมหลังการเก็บเกี่ยว การเน่าเปื่อยของเสาวรส (Passiflora edulis) และการวิเคราะห์เส้นทางการเปรียบเทียบมัลติโอมิกส์เผยให้เห็น สีม่วงมีความทนทานมากกว่า nt ต่อเชื้อโรคมากกว่าพันธุ์สีเหลือง j Fungi (Basel). 2021;7(10):879. เผยแพร่เมื่อวันที่ 19 ต.ค. 2021 doi:10.3390/jof 7100879 (รหัส:5.816)
[6] LiT, Zhou B, Luo Z และคณะ ลักษณะโครงสร้างของ การทำให้เป็นกลางของนาโนบอดีด้วยกิจกรรมที่กว้างขวางต่อต้าน SARS-CoV-2 Variants. Front Microbiol. 2022;13:875840. เผยแพร่เมื่อวันที่ 2 มิถุนายน 2022 doi:10.3389/fmicb.2022875840 (ถ้า:5.640)
[7] Wang T, Ren D, Guo H และคณะ CgSCD1 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์เมลานินและการก่อโรค ของ Colletotrichum gloeosporioides. pathogens. 2020;9(2) :141. เผยแพร่เมื่อ 20 กุมภาพันธ์ 2020 doi:10.3390/pathogens9020141(IF:3.018) :141. เผยแพร่เมื่อ 20 กุมภาพันธ์ 2020 doi:10.3390/เชื้อโรค9020141 (IF:3.018)
[8] Lv Y, LiX, Zhang H, Zou F, Shen B. โปรไฟล์การแสดงออกของ CircRNA ในผู้ที่ไวต่อและต้านทานเดลตาเมทริน
pipiens pallens (Diptera: Culicidae) คอมพ์ไบโอเคม ฟิสิออล บี ไบโอเคม โมล ไบโอล. 2022;261:110750. doi:10.1016 /j.cbpb.2022.110750 (รหัส:2.231)
[9] Hu M, DaiX การยับยั้งการเจริญเติบโตโดยการเปลี่ยนแปลง (p) ppGpp ระดับผลลัพธ์จากการจัดสรรทรัพยากรที่ไม่เหมาะสมใน Escherichia coli[J]. การวิจัยกรดนิวคลีอิก 2019, 47(9): 4684-4693.(อส11.6)
[10] Guo L, Yang W, Huang Q และคณะ สเปกโตรเมทรีมวลเฉพาะเซเลโนซิสเตอีนเผยให้เห็นเซเลโนโปรตีโอมที่แยกจากเนื้อเยื่อและเซเลโนโปรตีนที่คาดว่าจะเป็น [J] เคมีเซลล์ ชีววิทยา, 2561, 25(11): 1380-1388. e4. (IF6.762)
2.6 สิ่งพิมพ์ที่ใช้ผลิตภัณฑ์ PCR (บางส่วน)
[1] หวาง อี้ ฟู่ ซี, ลิ๊กซ์, เอต อัล. ไซโทพลาสซึม การตรวจจับดีเอ็นเอ โดย ก.ก. ซับซ้อน ใน อายุมาก ซีดี4+ ที เซลล์ เสริมฤทธิ์ ที เซลล์ แอคทีฟ ความสัมพันธ์ และ ที่เกี่ยวข้องกับความชรา ภูมิคุ้มกันตนเอง การอักเสบ ภูมิคุ้มกัน 2021;54(4):632-647.e9 ดอย:10.1016/จ.อ.ม.
ni.2021.02.003(IF:31.745)
[2] หยางเอ็กซ์, เกา เอฟ, จาง ดับเบิ้ลยู เอต อัล. "ดาว" มิอาร์-34เอ และ ซีเอ็กซ์ซีอาร์4 ตัวร้าย ซึ่งเป็นรากฐาน นาโนเพล็กซ์สำหรับ ไบนาร์ย สหกรณ์ การรักษาผู้อพยพ อีกครั้งที การแพร่กระจาย หน้าอก โรคมะเร็ง. เจ ควบคุม เผยแพร่. 2020;326:615-627. doi:10.1016/จ. jconrel.2020.07.029(รหัส:7.727)
[3] เฉียวอี้ ดูเจ, เกอ อาร์, เอต อัล. เอ ตัวอย่าง และ การตรวจจับ ไมโครนีดเดิล แพทช์ สำหรับ โรคสะเก็ดเงิน ไมโครอาร์เอ็นเอ ไบโอมาร์กเกอร์
การวิเคราะห์ ใน อินเตอร์สติเชียล ของเหลว. ทวารหนัก เคมี. 2022;94(14):5538-5545. doi:10.1021/acs.analchem.1c04401 (ข้อมูลอ้างอิง: 6.986)
[4] หลิน คิว เย่ เอ็กซ์ ฮวง ซี, เอต อัล. กราฟีน ออกไซด์เป็นฐาน การปราบปราม ของ ไม่ระบุเมือง ใน วงจรผ่านสื่อ ไอโซเทอร์ การขยายสัญญาณผิดปกติ การเปิดใช้งานความละเอียดอ่อน การตรวจจับ ของไซโคลออกซิเจเนส-2 เอ็มอาร์เอ็นเอ ใน ลำไส้ใหญ่และทวารหนัก มะเร็ง.ทวารหนัก เคมี. 2019;91(24):15694-15702. doi:10.1021/acs.analchem.9b03861(ถ้า:6.350)
[5] หลิน ถาม, ฮวง Z,เย่ เอ็กซ์, เอต อัล. แล็ป ใน เอ หลอด: การแยกตัว, การสกัด และ เป็นอื่นๆ การขยายเสียง การตรวจจับ ของ เอ็กโซโซม ยาว การไม่เข้ารหัส อาร์เอ็นเอ ของกระเพาะอาหาร มะเร็ง. ทาลันต้า. 2021;225:122090.
doi:10.1016/j.tta.2021.122090(แก้ไข:6.057)
[6] หลิว ซี, โจว จี, เอต อัล. 5-ฟอร์มิลูราซิล เช่น เอ มัลติฟังก์ชันการทำงาน อาคาร ปิดกั้น ใน ไบโอเซนเซอร์ แบบร่าง[J]. อังเจว เคมี อินท์ เอ็ด อังกฤษ 26 ก.ค. 2561;57(31):9689-9693.（IF 11.992）
[7] หวัง เอ็ม, จาง ส, เจิ้ง จี, เอต อัล. กำไรจากฟังก์ชัน มิวตัทไอออน ของการ์ด14 นำไปสู่ เกิดขึ้นโดยธรรมชาติ โรคสะเก็ดเงินคล้าย ผิว การอักเสบผ่าน ปรับปรุงให้ดีขึ้น เซลล์เคอราติโนไซต์ การตอบสนองต่อ อิล-17เอ ภูมิคุ้มกัน 2018;49(1):66-79.e5.
ดอย:10.1016/j.immuni.2018.05.012(IF:19).734)
[8] จางอี้ ดิง เอช หวาง เอ็กซ์ เอต อัล. เอ็มเค2 ส่งเสริม ทีเอฟซีพี2แอล1 ความเสื่อมโทรม ทาง เบต้า-TrCP ยูบิควิติน ลอิกาเซ่ ถึง ควบคุม หนู ลำต้นของตัวอ่อน การต่ออายุตัวเองของเซลล์ เซลล์ ส.ส.2021;37(5):109949. ดอย:10.1016/j.celrep.2021.109949 (ไอเอฟ:9.423)
[9] หลิน คิว เย่ เอ็กซ์ หยาง บี, เอต อัล. แบบเรียลไทม์ การเรืองแสง วงจรที่ควบคุมโดยวงจร อุณหภูมิคงที่ ขยายเสียงสถานะ การทดลอง สำหรับ รวดเร็ว และ อ่อนไหว การตรวจจับ ของสเตรปโตค็อกคัส สกุล gallolyticus กัลโลลิตไอคัส เกี่ยวข้องกับ ลำไส้ใหญ่และทวารหนัก โรคมะเร็ง[J]
การวิเคราะห์ และ การวิเคราะห์ทางชีวภาพ เคมี2019, 411(26): 6877-6887.（IF6.35）
[10] หลิน คิว เย่ เอ็กซ์ ฮวง ซี, เอต อัล. กราฟีน ออกไซด์เป็นฐาน การปราบปราม ของ ไม่ระบุเมือง ใน วงจรผ่านสื่อ ไอโซเทอร์ การขยายสัญญาณผิดปกติ การเปิดใช้งานความละเอียดอ่อน การตรวจจับ ของไซโคลออกซิเจเนส-2 เอ็มอาร์เอ็นเอ ใน สีแคลตัล มะเร็ง[J]. การวิเคราะห์ แคล เคมี, 2019.（IF6.35）
การอ้างอิง:
[1] Loeb LA, Jr R. DNA โพลิเมอเรสและโรคของมนุษย์[J] Nature Reviews Genetics