การทดลอง qPCR อาจดูง่ายหรือบางครั้งก็ยาก หลังจากออกแบบไพรเมอร์เสร็จแล้ว จะมีการเติมตัวอย่าง qPCR ทีละขั้นตอนเหมือน PCR และทำการทดลองบนเครื่องได้ มีปัญหาทั่วไปหลายประการในการทดลอง qPCR โดยใช้สีย้อม และเมื่อพิจารณาจากสาเหตุและแนวทางแก้ไขที่เป็นไปได้ เราหวังว่าคุณจะสามารถใช้สิ่งเหล่านี้เพื่อแก้ไขปัญหาในการทดลอง qPCR ได้

1. qPCR คืออะไร?
2. กราฟขยาย qPCR ที่ผิดปกติ
3. กราฟการหลอมเหลวของ qPCR ที่ผิดปกติ
4. ข้อมูลการสั่งซื้อ
5. สินค้าที่เกี่ยวข้อง
6. เรื่องการอ่านหนังสือ

1. qPCR คืออะไร?

นับตั้งแต่มีการคิดค้นเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) PCR อาจเป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในชีววิทยาโมเลกุลเนื่องจากความเรียบง่าย ราคาถูก ความน่าเชื่อถือ ความรวดเร็ว และความไวสูง qPCR เป็นเทคโนโลยีที่พัฒนาโดยเทคโนโลยี PCR ในระหว่างกระบวนการขยาย DNA วิธีการตรวจจับปริมาณผลิตภัณฑ์ทั้งหมดหลังจากแต่ละรอบ PCR ด้วยสีย้อมเรืองแสงไม่เพียงแต่มีความรวดเร็วและความไวของ PCR เท่านั้น แต่ยังมีความจำเพาะเจาะจงมากขึ้น รวมถึงการเฝ้าติดตามแบบเรียลไทม์ที่สูง การวัดปริมาณที่ทำซ้ำได้และแม่นยำ และข้อดีอื่นๆ qPCR เป็นเทคโนโลยีที่ใช้เครื่องขยายปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ คือ เครื่องมือ qPCR เพื่อตรวจสอบผลิตภัณฑ์การขยายกรดนิวคลีอิกแบบเรียลไทม์ระหว่างกระบวนการ PCR qPCR ดำเนินการวิเคราะห์เชิงปริมาณของเทมเพลตเริ่มต้นผ่านการวิเคราะห์ค่า Ct และเส้นโค้งมาตรฐาน ในปี 1992 Higuchi ชาวญี่ปุ่นได้เสนอ "เทคโนโลยี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์" เป็นคนแรก ในปี 1996 บริษัท American Biological ได้เปิดตัวเครื่องมือ PCR เชิงปริมาณเรืองแสงเครื่องแรกของโลก ซึ่งประกอบด้วยระบบวงจรความร้อนของการขยาย PCR ระบบออปติกตรวจจับการเรืองแสง และซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์และแอปพลิเคชัน สามารถตรวจสอบผลิตภัณฑ์การขยายกรดนิวคลีอิกแบบเรียลไทม์ผ่านสีย้อมเรืองแสงหรือโพรบเรืองแสง โดยผ่านความสัมพันธ์ของฟังก์ชันทางคณิตศาสตร์ รวมกับซอฟต์แวร์สำหรับการวิเคราะห์ผลลัพธ์ การคำนวณปริมาณเทมเพลตเริ่มต้นของตัวอย่างที่จะทดสอบจึงเกิดขึ้นได้ ดังนั้น เทคโนโลยี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์จึงถูกใช้กันอย่างแพร่หลาย วิธีการติดฉลากเรืองแสงสำหรับ qPCR แบ่งออกเป็นวิธีโมเสกสีย้อมเรืองแสงตามวิธีสีย้อม SYBR Green I วิธีโพรบเรืองแสงตามวิธีโพรบ Taqman (Cycling Probe, Molecular Bracon เป็นต้น) วิธีไพรเมอร์สีย้อมดับ

การทดลอง qPCR อาจดูง่ายหรือบางครั้งก็ยาก หลังจากออกแบบไพรเมอร์เสร็จแล้ว จะเพิ่มตัวอย่าง qPCR ทีละขั้นตอนเหมือน PCR และทำการทดลองบนเครื่องได้ อย่างไรก็ตาม รายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ หลายอย่างต้องใส่ใจ เช่น ไม่มีของเหลวแขวนบนผนังท่อ ไม่มีฟองอากาศในท่อ และความจำเป็นที่จะต้องลดการสัมผัสโดยตรงระหว่างผนังท่อ ฝาท่อ ฯลฯ เพื่อลดข้อผิดพลาดในการทดลองหรือผลการทดลองที่แปลกประหลาด Xiaoyi ได้รวบรวมปัญหาทั่วไปหลายประการในการทดลอง qPCR โดยใช้สีย้อม และให้สาเหตุและแนวทางแก้ไขที่เป็นไปได้ ซึ่งเราหวังว่าคุณจะใช้แก้ไขปัญหาในการทดลอง qPCR ได้

2. กราฟขยาย qPCR ที่ผิดปกติ

2.1 ความผิดปกติในเฟสพื้นฐานของกราฟลอการิทึมของเส้นโค้งการขยาย

รูปที่ 1. กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

การตั้งค่าพื้นฐานไม่ถูกต้อง

วิธีแก้ไข:

ขอแนะนำให้เพิ่มค่าปลายทางของเส้นฐานแผนภาพตัวอย่างการปรับปรุงมีดังนี้

รูปที่ 2. กราฟการขยาย

2.2 กราฟลอการิทึมการขยายกราฟการแบ่งส่วนกราฟ

รูปที่ 3. กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

เส้นฐานตั้งไว้สูงเกินไป

วิธีแก้ไข:

ขอแนะนำให้ลดค่าจุดสิ้นสุดของเส้นฐาน ตัวอย่างไดอะแกรมการปรับมีดังนี้

2.3 กราฟเส้นตรงของการขยายสัญญาณที่ไม่ราบรื่น

รูปที่ 4. กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1) ท่อปฏิกิริยา PCR ไม่ได้ปิดฝาให้แน่นและสารละลายปฏิกิริยาก็รั่วไหล
2)สารละลายปฏิกิริยา PCR แบบแขวนผนัง
3) เครื่องมือไม่ได้รับการสอบเทียบ (รวมถึงการสอบเทียบอัตโนมัติ หรือการสอบเทียบ ROX)
4) ระบบมีสารยับยั้งจำนวนมาก ทำให้เกิดการเรืองแสงที่ไม่เสถียร
5) การใช้งานเครื่องมือมากเกินไปส่งผลให้การรวบรวมฟลูออเรสเซนต์ไม่เสถียร

วิธีแก้ไข:

1) กดฝาครอบท่อให้แน่น
2) ผสมสารเคมีให้ทั่วและใส่ลงในเครื่องมือวัดปริมาณอย่างระมัดระวังหลังจากการปั่นเหวี่ยงจนเสร็จ
3)ปรับเทียบเครื่องมือ
4) ปรับปรุงความบริสุทธิ์ของ RNA และเลือกรีเอเจนต์การถอดรหัสย้อนกลับที่เหมาะสม

2.4 กราฟเส้นขยายโค้งซิกแซกที่ระดับราบ

รูปที่ 5 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   ความบริสุทธิ์ของ RNA ไม่ดีและมีสิ่งเจือปนอยู่มาก
2)   ใช้เครื่องดนตรีมานานเกินไป

วิธีแก้ไข:

1)   การสกัด RNA คุณภาพสูงกลับมาอีกครั้ง
2)   เจือจางเทมเพลต RNA เพื่อลดความเข้มข้นของสิ่งเจือปน
3)   สอบเทียบเครื่องมือวัด

2.5 กราฟเส้นตรงของเส้นโค้งการขยายไม่สามารถไปถึงระดับคงที่ได้

รูปที่ 6 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   ความเข้มข้นของเทมเพลตต่ำ (ค่า Ct ประมาณ 35)
2)   รอบขยายเสียงน้อยเกินไป
3)   ประสิทธิภาพการขยายรีเอเจนต์ต่ำ (Ct เล็กแต่ไม่สามารถไปถึงระดับคงที่ได้)

วิธีแก้ไข:

1)   เพิ่มความเข้มข้นของเทมเพลต
2)   เพิ่มจำนวนรอบ
3)   เพิ่มแมกนีเซียม²⁺ ความเข้มข้น.

2.6 กราฟเส้นขยายความลาดเอียงของที่ราบสูง

รูปที่ 7 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   การปรากฏตัวของความเสื่อมโทรม (ความเสื่อมโทรมของผลิตภัณฑ์ขยาย, ความเสื่อมโทรมของ SYBR)
2)   ฝาหลอดทดลองไม่ได้รับการปิดอย่างถูกต้อง และสารเคมีก็ระเหยไป
3)   ความเข้มข้นของ cDNA สูงเกินไป (หากค่า Ct ต่ำเกินไป เกณฑ์การเรืองแสงจะเพิ่มขึ้น และการหย่อนคล้อยจะรุนแรงมากขึ้น)
4)   มีฟองอากาศอยู่ในท่อแล้วก็หายไป

วิธีแก้ไข:

1)   ปรับปรุงความบริสุทธิ์ของระบบ
2)   ลดปริมาณ cDNA (เจือจางเทมเพลต)
3)   ลดค่าจุดสิ้นสุดของเส้นฐาน

2.7 ค่า Ct มีขนาดใหญ่ในเส้นโค้งการขยาย

รูปที่ 8 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   จำนวนเทมเพลตน้อย
2)   ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณต่ำ
3)   ชิ้นส่วน PCR ยาวเกินไป
4)   การมีสารยับยั้งอยู่ในระบบปฏิกิริยา

วิธีแก้ไข:

1)   ลดเวลาการเจือจางหรือเพิ่มปริมาณเทมเพลตให้ค่า Ct อยู่ระหว่าง 15 ถึง 30 ให้ได้มากที่สุด
2)   ปรับปรุงเงื่อนไขปฏิกิริยา ลองใช้ขั้นตอนการขยายสามขั้นตอน หรือออกแบบไพรเมอร์ใหม่
3)   ความยาวของผลิตภัณฑ์ PCR ออกแบบให้อยู่ระหว่าง 100 -150 bp ไม่แนะนำให้เกิน 300 bp
4)   การผลิตซ้ำเทมเพลตที่มีความบริสุทธิ์สูง

2.8 ความสามารถในการทำซ้ำของเส้นโค้งการขยายสัญญาณไม่ดี

รูปที่ 9 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   ข้อผิดพลาดในการสไปก์ขนาดใหญ่
2)   สารเคมีและระบบต่างๆ ยังไม่ผสมเข้ากันได้ดี
3)   จำนวนสำเนาของ cDNA ต่ำ
4)   ไม่ได้ใช้การสอบเทียบ Rox

วิธีแก้ไข:

1)   การสอบเทียบปิเปต
2)   การผสมระบบปฏิกิริยาอย่างทั่วถึง
3)   ความเข้มข้นของเทมเพลตต่ำ ความสามารถในการทำซ้ำต่ำ หลุมผสม 4-6 หลุม และค่าที่เบี่ยงเบน 1-2 ค่าสามารถละทิ้งได้อย่างเหมาะสม
4)   ควรใช้การปรับเทียบ Rox หากรีเอเจนต์ที่ใช้ไม่มี Rox จะต้องเลือกสีอ้างอิงเป็น None

2.9 เส้นโค้งการขยายแบบสุ่ม

รูปที่ 10 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

ความไม่ตรงกันระหว่างความเข้มข้นของ Rox และแบบจำลอง

วิธีแก้ไข:

เปลี่ยนการตั้งค่าสีอ้างอิงบนเครื่องดนตรีจาก ROX เป็น NONE และดูว่าเส้นโค้งการขยายสัญญาณกลับมาเป็นปกติหรือไม่

2.10 พีคกิ้ง NTC

2.10.1 Ct>35, ค่า Tm ของเส้นโค้งการหลอมเหลว <80℃

รูปที่ 11 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

ผลลัพธ์ของการสร้างไดเมอร์ของไพรเมอร์

วิธีแก้ไข:

ไพรเมอร์ที่ได้รับการเพิ่มประสิทธิภาพ

2.10.ค่า 2 Ct <35, กราฟการหลอมละลายของ NTC และกราฟการหลอมละลายของยีนทับซ้อนกัน

รูปที่ 12 กราฟการขยาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

การปนเปื้อนของระบบปฏิกิริยา

วิธีแก้ไข:

ตรวจสอบแหล่งกำเนิดมลพิษทีละแห่ง

3. กราฟการหลอมเหลวของ qPCR ที่ผิดปกติ

3.1 กราฟการหลอมละลายแบบจุดเดียวแต่ไม่คมชัด

รูปที่ 13 กราฟเส้นโค้งการละลาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   มันเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบของสารเคมีและแบบจำลองเครื่องมือ
2)   การมีอยู่ของการขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจงของชิ้นส่วนที่มีขนาดใกล้เคียงกัน

วิธีแก้ไข:

1)   ช่วงอุณหภูมิตั้งแต่จุดเริ่มสูงสุดจนถึงจุดสิ้นสุดสูงสุดไม่สูงกว่า 7°C ผลลัพธ์ถือว่าใช้ได้ กล่าวคือ จุดสูงสุดครั้งเดียว
2)   ดำเนินการอิเล็กโทรโฟรีซิสอะกาโรสที่มีความเข้มข้นสูง (เช่น อะกาโรส 3%) เพื่อช่วยในการกำหนด

3.2 เส้นโค้งการหลอมเหลวมีจุดสูงสุดสองเท่า และจุดสูงสุดที่ต่ำกว่า Tm อยู่ก่อนถึง 80°C

รูปที่ 14 กราฟเส้นความแตกแยก

สาเหตุที่เป็นไปได้:

การปรากฏตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์

วิธีแก้ไข:

เพิ่มอุณหภูมิการอบ ลดความเข้มข้นของไพรเมอร์ หรือออกแบบไพรเมอร์ใหม่

3.3 เส้นโค้งการหลอมเหลวมีจุดยอดสองเท่า และจุดยอดต่ำสุด Tm อยู่หลังอุณหภูมิ 80°C

รูปที่ 15 เส้นโค้งการแยกตัว

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   ความจำเพาะของไพรเมอร์ที่ไม่ดีนำไปสู่การเพิ่มปริมาณผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง
2)   การปนเปื้อนของ gDNA

วิธีแก้ไข:

1)   การตรวจสอบความเฉพาะของไพรเมอร์บลาสต์เช็ค ออกแบบใหม่หากไม่ดี
2)   การยืนยันโดย NRC การควบคุมเชิงลบ หากมี จำเป็นต้องเตรียมเทมเพลตใหม่

3.4 จุดสูงสุดของเส้นโค้งการหลอมละลายที่ยุ่งเหยิง

รูปที่ 16 กราฟเส้นโค้งการละลาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

1)   การปนเปื้อนของระบบปฏิกิริยา
2)   การสัมผัสของสารเคมีกับแสงสว่างหรืออุณหภูมิสูงอาจทำให้สารเคมีทำงานล้มเหลวได้
3)   เครื่องมือไม่ได้รับการสอบเทียบมาเป็นเวลานานแล้ว
4)   ความไม่ตรงกันระหว่างวัสดุสิ้นเปลืองและเครื่องมือ

วิธีแก้ไข:

1)   การรวมผล NTC และ NRC เพื่อยืนยันการปนเปื้อน ขอแนะนำให้แยกการปนเปื้อนออกจากน้ำ ไพรเมอร์ เอนไซม์ และสิ่งแวดล้อมทีละอย่าง
2)   ขอแนะนำให้ทำการทดลองเปรียบเทียบกับสารเคมีใหม่
3)   ขอแนะนำให้บำรุงรักษาเครื่องมือสอบเทียบเป็นประจำ
4)   ยืนยันข้อกำหนดของเครื่องมือที่เกี่ยวข้องกับวัสดุสิ้นเปลือง

3.5 จุดยอดปลอมที่ปลายด้านหน้าของเส้นโค้งการหลอมละลาย

รูปที่ 17 กราฟเส้นโค้งการหลอมละลาย

สาเหตุที่เป็นไปได้:

ความเข้มข้นของ Rox ไม่ตรงกับแบบจำลอง

วิธีแก้ไข:

ขอแนะนำให้ยกเลิกการแก้ไข Rox เพื่อดูว่าเส้นโค้งการหลอมเหลวเป็นปกติหรือไม่

รูปที่ 18 กราฟเส้นโค้งการหลอมละลาย

4. ข้อมูลการสั่งซื้อ

ตารางที่ 1 ข้อมูลการสั่งซื้อ

5. สินค้าที่เกี่ยวข้อง

ผลิตภัณฑ์ที่จัดทำโดย Yeasen มีดังนี้.

ตารางที่ 2 สินค้าที่เกี่ยวข้อง

6. เรื่องการอ่านหนังสือ

DNase I และการประยุกต์ใช้ในชีวการแพทย์

แนวทางการคัดเลือกเอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับ