การเพิ่มประสิทธิภาพของการผลิตอุตสาหกรรมและการทำให้บริสุทธิ์ของ mRNA ที่เปลี่ยนตัวเอง

แม้ว่าเทคโนโลยี mRNA จะประสบความสำเร็จเป็นอย่างดีในช่วงที่มีการระบาดใหญ่และแสดงให้เห็นถึงศักยภาพที่ยอดเยี่ยม แต่เทคโนโลยีดังกล่าวยังคงมีข้อจำกัดหลายประการ เช่น เวลาแสดงออกที่สั้นและการแปลโปรตีนที่จำกัด แม้ว่าคุณสมบัติเหล่านี้อาจให้ความปลอดภัยได้ในระดับหนึ่ง แต่ก็กลายเป็นข้อจำกัดสำหรับการบำบัด เช่น การทดแทนโปรตีน ซึ่งต้องใช้การให้ยาซ้ำหลายครั้งเพื่อรักษาระดับการแสดงออกของโปรตีน ทำให้เกิดความเสี่ยงและความท้าทายใหม่ๆ เช่น ภูมิคุ้มกันและแอนติบอดีที่เป็นกลาง

RNA ที่ขยายตัวได้เอง (saRNA) สามารถสร้างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันได้เหมือนกันในปริมาณที่น้อยกว่า mRNA ทั่วไปหลายร้อยหรือหลายพันเท่า ปริมาณที่น้อยลงหมายถึงต้นทุนการผลิตที่ลดลง และการฉีดที่น้อยลงสามารถลดผลข้างเคียงที่เป็นพิษจาก mRNA และเวกเตอร์นำส่งได้ ปัจจุบัน มี saRNA หลายตัวที่เข้าสู่การทดลองทางคลินิกทั่วโลก บริษัทใหญ่ๆ เช่น BioNTech กำลังพัฒนาเทคโนโลยี saRNA อย่างแข็งขัน

แม้ว่า saRNA จะมีข้อได้เปรียบด้านต้นทุนและความปลอดภัยที่สำคัญ แต่โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์ของ saRNA ก็ทำให้เกิดความท้าทายใหม่ในการผลิต โมเลกุล saRNA ซึ่งรวมลำดับการเข้ารหัส RNA polymerase เข้ากับลำดับโปรตีนเป้าหมายนั้นมีขนาดใหญ่กว่า (~10 กิโลเบส) และซับซ้อนกว่า (มีโครงสร้างรองมากกว่า) เมื่อเทียบกับ mRNA แบบดั้งเดิม ซึ่งทำให้ปฏิกิริยาการถอดรหัสในหลอดทดลองมีความยากมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ทำให้ผลผลิตและความบริสุทธิ์ของการผลิต saRNA ลดลง ดังนั้น การผลิต saRNA จึงต้องมีมาตรฐานที่สูงขึ้นในกระบวนการสังเคราะห์ การแยก และการทำให้บริสุทธิ์

โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้ ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้ในการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ มีปัญหา เช่น ผลผลิตเป้าหมายและความสมบูรณ์ต่ำ การรวมวิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีหลายวิธีเข้าด้วยกัน (เช่น การเติมโครมาโทกราฟีเซลลูโลส โครมาโทกราฟีเฟสย้อนกลับแบบไม่ชอบน้ำ) เป็นเรื่องยุ่งยาก ทำให้เกิดสิ่งเจือปนใหม่ มีอัตราการฟื้นตัวต่ำ และมีราคาแพง นอกจากนี้ ระบบปฏิกิริยา IVT ที่ใช้สำหรับการผลิตขนาดใหญ่ได้รับการปรับให้เหมาะสมจากระบบที่เหมาะสำหรับการสังเคราะห์ลำดับกรดนิวคลีอิก 100nt ทำให้ไม่เหมาะสำหรับ saRNA ที่มีขนาดใหญ่กว่า 10kb ซึ่งทำให้จำเป็นต้องปรับให้เหมาะสมของระบบปฏิกิริยา IVT ที่มีอยู่ ในปัจจุบัน วิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วย mRNA แบบเดิมไม่สามารถตอบสนองข้อกำหนดด้านคุณภาพของของเหลวดิบในอุตสาหกรรมได้ ดังนั้น จึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วนในการพัฒนาและปรับปรุงกระบวนการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ในระดับอุตสาหกรรมที่สมบูรณ์และมีประสิทธิภาพสำหรับ RNA ที่ขยายตัวได้เอง

การเพิ่มประสิทธิภาพของการผลิตทางอุตสาหกรรมและวิธีการทำให้บริสุทธิ์

ในการพัฒนาระบบการผลิตทางอุตสาหกรรมสำหรับ mRNA ที่ขยายตัวได้เอง (saRNA) จำเป็นต้องปรับให้เหมาะสมของประเภทไอออนบัฟเฟอร์และส่วนประกอบในระบบโคทรานสคริปชัน IVT ในระดับเล็กก่อน ซึ่งยังรวมถึงการปรับปรุงอัตราส่วนบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟีและล้างตัวอย่างสำหรับกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ในขั้นตอนปลายน้ำ จากนั้นจึงสามารถขยายเงื่อนไขที่ปรับให้เหมาะสมเหล่านี้ให้ใหญ่ขึ้นเพื่อตรวจสอบว่าระบบสามารถเพิ่มกำลังการผลิตและปรับปรุงคุณภาพของผลิตภัณฑ์ดิบได้อย่างมีประสิทธิภาพหรือไม่

ระบบปฏิกิริยาการเติมแคปโคทรานสคริปชัน

ในระบบปฏิกิริยาการเติมแคปโคทรานสคริปชัน ส่วนประกอบบัฟเฟอร์ T7 ได้แก่ HEPES 400mM สเปอร์มิดีน 20mM DTT 100mM และเกลือ Mg2+

บัฟเฟอร์ T7 - ​​ประเภทเกลือแมกนีเซียมไอออน

ประเภทของเกลือแมกนีเซียมไอออนที่ใช้ส่งผลต่อผลผลิตและความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ saRNA เป้าหมาย

1. สำหรับการสังเคราะห์ cotranscription ขนาดเล็กของ mRNA 1 มก. การใช้ Mg(OAc)2 เป็นเกลือ Mg2+ จะทำให้ได้ผลผลิตและความสมบูรณ์ที่ดีที่สุด โดยมีค่า 100.5 ไมโครกรัม และ 62.9% ตามลำดับ
2. ในทางกลับกัน การใช้เกลือแมกนีเซียมไอออนชนิดอื่น เช่น MgCl2 และ MgSO4 จะลดผลผลิตลงประมาณ 25-50% และความสมบูรณ์ลงประมาณ 10% ทำให้ทั้งผลผลิตและความสมบูรณ์ลดลงอย่างมาก

บัฟเฟอร์ T7 - ​​ความเข้มข้นของไอออนแมกนีเซียม

ความเข้มข้นที่เหมาะสมของไอออนแมกนีเซียมอะซิเตท (30-50mM) จะช่วยเพิ่มผลผลิตและความสมบูรณ์ของ saRNA เป้าหมาย โดยให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดที่ 35mM

1. ที่ความเข้มข้นของไอออนแมกนีเซียมอะซิเตท 30-50mM ผลผลิต saRNA จะอยู่ที่ 88.5-100.5µg และความสมบูรณ์อยู่ที่ 58.6-62.9% ซึ่งแสดงผลลัพธ์ที่ดี
2. ที่ความเข้มข้น 35mM ผลผลิตและความสมบูรณ์จะสูงที่สุด โดยไปถึง 100.5µg และ 62.9% ตามลำดับ

บัฟเฟอร์ T7 - ​​เกลือแมกนีเซียมไอออนรวมกับเกลือชนิดอื่น

การเติมเกลืออื่นๆ ลงในบัฟเฟอร์ T7 สามารถปรับปรุงผลผลิตและความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์เป้าหมายได้อย่างมาก

1. บัฟเฟอร์เบส T7 ประกอบด้วย HEPES 400mM, สเปอร์มิดีน 20mM, DTT 100mM และเกลือ Mg2+ ส่งผลให้ได้ผลผลิตและความสมบูรณ์ที่ 100.5µg และ 62.9% ตามลำดับ
2. การเติมเกลือชนิดที่สอง NaOAc จะช่วยเพิ่มผลผลิตและความสมบูรณ์มากยิ่งขึ้น โดยให้ผลผลิตเพิ่มขึ้น 20-110 ไมโครกรัม และความสมบูรณ์ดีขึ้นประมาณ 2-8%

บัฟเฟอร์ T7 - ​​ความเข้มข้นของเกลือรวม

เมื่อส่วนประกอบเกลือตัวที่สอง NaOAc (Na+) มีความเข้มข้น 5-30mM ผลผลิตและความสมบูรณ์ของ saRNA เป้าหมายจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยความเข้มข้นที่ดีที่สุดอยู่ที่ 15mM

1. ที่ความเข้มข้นของ Na+ 3-30mM ผลผลิต saRNA จะอยู่ที่ 120-210µg และความสมบูรณ์อยู่ที่ 64.4-70.2% ซึ่งแสดงผลลัพธ์ที่ดี
2. ที่ความเข้มข้นของ Na+ ที่ 15mM ผลผลิตและความสมบูรณ์จะสูงที่สุด โดยไปถึง 210µg และ 70.2% ตามลำดับ

วิธีการทำให้บริสุทธิ์แบบเดี่ยว

ในระหว่างการผลิตและการทำให้บริสุทธิ์ของ saRNA ในปริมาณน้อย (<50 มก.) การใช้กรรมวิธีทำให้บริสุทธิ์ที่แตกต่างกันสามารถลดปริมาณ dsRNA และปริมาณโปรตีนที่ตกค้างได้อย่างมาก ทำให้ได้ผลผลิตสูง มีประสิทธิภาพในการปิดฝา และความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ ประสิทธิภาพของกรรมวิธีทำให้บริสุทธิ์จากดีที่สุดไปแย่ที่สุด ได้แก่ โครมาโตกราฟีแบบสัมพันธ์ > การตกตะกอนลิเธียมคลอไรด์ > อัลตราฟิลเตรชัน และโครมาโตกราฟีเซลลูโลส

1. โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้

สำหรับการผลิต mRNA ในปริมาณมาก ควรใช้โครมาโทกราฟี ตัวเลือก ได้แก่ โครมาโทกราฟีเฟสย้อนกลับ โครมาโทกราฟีแลกเปลี่ยนไอออน โครมาโทกราฟีไฮโดรโฟบิก และโครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์กัน ซึ่งแต่ละตัวเลือกมีข้อดีและข้อเสียต่างกัน โครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์กันซึ่งมักใช้สำหรับจับโพลี(A) mRNA ให้ความสามารถในการปรับขนาดและโซลูชันแพลตฟอร์มที่มีอัตราการฟื้นตัวมากกว่า 90%

คุณสมบัติโครงสร้างหลักของ mRNA ได้แก่ แคป 5' และหางโพลี(A) 3' ช่วยให้การชำระล้างทำได้ง่ายขึ้น โครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์กันนั้นคล้ายกับการชำระล้างด้วยลูกปัดแม่เหล็ก โดยใช้ลูกปัดที่เชื่อมกับ dT เพื่อจับ mRNA หางโพลี(A) สภาวะที่มีเกลือสูงจะป้องกันประจุลบ ทำให้จับผ่านพันธะไฮโดรเจน AT ได้ และ mRNA จะถูกชะออกภายใต้ค่า pH เป็นกลางที่อ่อนและสภาพการนำไฟฟ้าต่ำ

โครมาโทกราฟีแบบมีความสัมพันธ์สำหรับ RNA เกี่ยวข้องกับ "การจับเกลือสูง การชะเกลือต่ำ" องค์ประกอบของบัฟเฟอร์ ขนาดโมเลกุล อุณหภูมิ และความเข้มข้นของตัวอย่างส่งผลกระทบอย่างมากต่อกระบวนการ การเลือกประเภทเกลือและความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดผ่านการทดลองถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการทำให้บริสุทธิ์อย่างมีประสิทธิภาพ

การทำให้บริสุทธิ์: วิธีนี้ทำให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่มีความสมบูรณ์สูงสุด (80.3%) มีปริมาณ dsRNA ต่ำที่สุด (0.01µg/mg) มีประสิทธิภาพการปิดฝาที่สูงที่สุด (96.4%) และมีปริมาณโปรตีนตกค้างน้อยที่สุด (1.20µg/mg) โดยมีปริมาณผลผลิต 136µg และอัตราการกู้คืน 65% ทำให้เป็นผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ์และคุณภาพดีที่สุด

2. วิธีการทำให้บริสุทธิ์อื่น ๆ :

การตกตะกอนลิเธียมคลอไรด์

หลักการในการทำให้ mRNA บริสุทธิ์โดยใช้ LiCl คือ ลิเธียมสามารถลดแรงผลักทางไฟฟ้าสถิตระหว่างโมเลกุลที่ค่า pH ที่กำหนด ทำให้สามารถตกตะกอน RNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพจากนั้นแยกตะกอนออกด้วยการปั่นเหวี่ยง แล้วละลายเพื่อให้ได้ตัวอย่าง RNA บริสุทธิ์ การตกตะกอนด้วย LiCl นั้นง่าย รวดเร็ว มีประสิทธิภาพสำหรับ mRNA ที่มีขนาดต่างๆ และให้ผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ์สูง อย่างไรก็ตาม ไอออนลิเธียมที่เหลือสามารถยับยั้ง mRNA ได้ ขอแนะนำให้ใช้การตกตะกอนด้วย LiCl สำหรับสารละลายที่มี RNA อย่างน้อย 400 µg/ml เพื่อให้แน่ใจว่ามีประสิทธิภาพในการทำให้บริสุทธิ์ วิธีนี้ให้ผลผลิตสูง (210µg) แต่ความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์มีเพียง 70.2% เท่านั้น ซึ่งทำให้คุณภาพของผลิตภัณฑ์ลดลงอย่างมาก จึงไม่เหมาะสำหรับการผลิตในปริมาณมาก

วิธีลูกปัดแม่เหล็ก：

ลูกปัดแม่เหล็กเป็นอนุภาคขนาดเล็กที่เคลื่อนที่ในทิศทางต่างๆ ภายใต้สนามแม่เหล็ก โดยทั่วไปประกอบด้วยแกนเหล็กออกไซด์และสารเคลือบภายนอก การทำให้บริสุทธิ์ด้วยลูกปัดแม่เหล็กเป็นเทคนิคทางชีววิทยาโมเลกุลทั่วไปที่ใช้ในการเพิ่มความเข้มข้นของโมเลกุล mRNA จากส่วนผสมอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ลูกปัดแม่เหล็กที่มีฟังก์ชันต่างกันจะมีกลุ่มฟังก์ชันพื้นผิวต่างกัน (เช่น ไฮดรอกซิล คาร์บอกซิล โอลิโก(dT) สเตรปตาวิดิน) เพื่อทำให้ไบโอโมเลกุลต่างๆ บริสุทธิ์

ลูกปัดแม่เหล็กคาร์บอกซิเลตสามารถทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยโมเลกุล mRNA จะจับกับโมเลกุลเหล่านี้ผ่านปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตภายใต้สภาวะที่เป็นกรด การปรับสภาวะจะช่วยให้จับและปล่อย mRNA ได้อย่างเลือกสรร mRNA ที่ยาวขึ้นซึ่งมีกลุ่มฟอสเฟตที่มีประจุลบที่ถูกเปิดเผยมากขึ้นจะจับกับลูกปัดได้ง่ายขึ้น สำหรับ mRNA ที่สั้นกว่า อาจต้องใช้ลูกปัดที่มีปริมาตรมากขึ้น ลูกปัดแม่เหล็กที่จับคู่โอลิโก(dT) นั้นคล้ายกับโครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์กัน โดยใช้การจับเฉพาะระหว่างหางโพลี(A) ของ mRNA และโอลิโก(dT) ของลูกปัด

การกรองระดับอุลตราฟิลเตรชั่น

วิธีนี้ส่งผลให้ความสมบูรณ์ของ saRNA ต่ำที่สุด ซึ่งต่ำกว่าโครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตีประมาณ 8% โดยมีปริมาณโปรตีนตกค้างสูงที่สุด (4.58 µg/mg)

โครมาโตกราฟีเซลลูโลส

วิธีนี้ทำให้ได้ปริมาณ dsRNA ต่ำ (0.009µg/mg) และอัตราการปิดฝาที่สูง (96.4%) อย่างไรก็ตาม ปริมาณโปรตีนที่เหลือจะสูงกว่าเล็กน้อย (5.30µg/mg) โดยมีอัตราการฟื้นตัวเพียง 57% และผลผลิต 120µg ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับที่ได้จากโครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์ (ประมาณ 10% และ 16µg ตามลำดับ)

กระบวนการฟอกอากาศ

ส่วนประกอบบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟี - การเติมตัวรีดิวซ์

การเติมตัวรีดิวซ์ลงในบัฟเฟอร์โครมาโทกราฟีในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์สามารถปรับปรุงความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ อัตราการกู้คืน และประสิทธิภาพการปิดฝาได้อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ลดระดับของ dsRNA และโปรตีนที่เหลือเป็นผลพลอยได้เมื่อเทียบกับการไม่เติมตัวรีดิวซ์

1. โดยไม่ต้องใช้ตัวรีดิวซ์:

- ผลผลิต: 136µg

- อัตราการฟื้นฟู : 65%

- ความซื่อสัตย์: 80.3%

- dsRNA: 0.01µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- ปริมาณโปรตีนตกค้าง: 1.20µg/mg

- สินค้ามีความบริสุทธิ์และคุณภาพดี.

2. ด้วยสารรีดิวซ์ (TCPE, DTT, β-mercaptoethanol):

- เพิ่มผลผลิตได้ 10-40µg

- อัตราการฟื้นตัวเพิ่มขึ้น 5-18%

- ความสมบูรณ์ดีขึ้นประมาณ 1-5%

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- dsRNA: ต่ำถึง 0.005µg/mg

- ปริมาณโปรตีนตกค้าง: ต่ำถึง 0.20µg/mg

- การปรับปรุงความบริสุทธิ์และคุณภาพของผลิตภัณฑ์อย่างมีนัยสำคัญ

ส่วนประกอบของบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟี - ประเภทของตัวรีดิวซ์

การเติมสารลดชนิดต่างๆ ลงในบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟีสามารถปรับปรุงความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ อัตราการกู้คืน และประสิทธิภาพการปิดฝาได้ ขณะเดียวกันก็ลดปริมาณ dsRNA และโปรตีนที่ตกค้าง TCPE ถือเป็นสารลดที่มีประสิทธิภาพสูงสุด

- ด้วย TCPE:

- ผลผลิต: 175µg

- อัตราการฟื้นฟู : 83%

- ความซื่อสัตย์ : 85.2%

- dsRNA: 0.005µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- โปรตีนตกค้าง: 0.20µg/mg

- สินค้ามีความบริสุทธิ์และคุณภาพเป็นเลิศ

ส่วนประกอบของบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟี - ความเข้มข้นของตัวรีดิวซ์

การเติมสารรีดิวซ์ที่ความเข้มข้น 5-15mM ในบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟีสามารถปรับปรุงความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ อัตราการกู้คืน และประสิทธิภาพการปิดฝาได้อย่างมีนัยสำคัญ ขณะเดียวกันก็ลดปริมาณ dsRNA และโปรตีนตกค้าง ความเข้มข้นที่เหมาะสมคือ 10mM

1. การเพิ่ม 5-15mM TCPE:

- ผลผลิต: 160-178µg

- อัตราการฟื้นตัว: 76-85%

- ความสมบูรณ์ : ประมาณ 85%

- dsRNA: 0.002-0.005µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- ปริมาณโปรตีนตกค้าง: 0.20-0.52µg/mg

- สินค้ามีความบริสุทธิ์และคุณภาพดี

2. ด้วย TCPE 10mM:

- ผลผลิต: 178µg

- อัตราการฟื้นฟู : 85%

- ความซื่อสัตย์: 85.4%

- dsRNA: 0.002µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- โปรตีนตกค้าง: 0.20µg/mg

- ความบริสุทธิ์และคุณภาพผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมที่สุด

อัตราส่วนการซัก

การควบคุมอัตราส่วนของบัฟเฟอร์โครมาโตกราฟีต่อน้ำฉีดในกระบวนการซัก (10-25):(75-90) สามารถปรับปรุงความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ อัตราการกู้คืน และประสิทธิภาพการปิดฝาได้อย่างมีนัยสำคัญ ขณะเดียวกันก็ลดปริมาณ dsRNA และโปรตีนตกค้าง อัตราส่วนที่เหมาะสมคือ 15:85

1. อัตราส่วน (10-25):(75-90):

- ผลผลิต: 150-179µg

- อัตราการฟื้นตัว: 71-85%

- ความซื่อสัตย์: 84-90%

- dsRNA: 0.002-0.006µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- โปรตีนตกค้าง: ประมาณ 0.20µg/mg

- สินค้ามีความบริสุทธิ์และคุณภาพดี

2. ด้วยอัตราส่วน 15:85:

- ผลผลิต: 179µg

- อัตราการฟื้นฟู : 85%

- ความซื่อสัตย์: 90.0%

- dsRNA: 0.002µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- โปรตีนตกค้าง: 0.20µg/mg

- ความบริสุทธิ์และคุณภาพผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสมที่สุด

วิธีการทำให้บริสุทธิ์แบบผสมผสาน

การใช้ชุดวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่แตกต่างกันสามารถลดระดับของ dsRNA และโปรตีนตกค้างในผลิตภัณฑ์ได้ ทำให้คุณภาพโดยรวมดีขึ้น ลำดับวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่แนะนำคือ: โครมาโตกราฟีแบบแอฟฟินิตี > อัลตราฟิลเตรชัน + โครมาโตกราฟีแบบแอฟฟินิตี > โครมาโตกราฟีแบบแอฟฟินิตี + โครมาโตกราฟีแบบเซลลูโลส > โครมาโตกราฟีแบบเซลลูโลส + อัลตราฟิลเตรชัน โครมาโตกราฟีแบบแอฟฟินิตีเพียงอย่างเดียวให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

1. โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้เพียงอย่างเดียว:

- ผลผลิต: 179µg

- อัตราการฟื้นฟู : 85%

- ความซื่อสัตย์: 90.0%

- dsRNA: 0.002µg/มก.

- ประสิทธิภาพการปิดฝา: 96.4%

- โปรตีนตกค้าง: 0.20µg/mg

- ผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์และคุณภาพสูงสุด

2. การกรองระดับอุลตราฟิลเตรชัน + โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้:

- ผลผลิต: 170µg (น้อยกว่าโครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์เพียงอย่างเดียว 9µg)

- อัตราการฟื้นตัว: 81% (น้อยกว่าการใช้โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้เพียงอย่างเดียว 4%)

- ความซื่อสัตย์ : 88.5%

- dsRNA: 0.0015µg/มก.

- ปริมาณโปรตีนตกค้าง: 0.18µg/mg

- ปริมาณ dsRNA และโปรตีนที่ตกค้างลดลงเล็กน้อยเมื่อเทียบกับการใช้โครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี้เพียงอย่างเดียว แต่ปริมาณผลผลิตและอัตราการฟื้นตัวลดลงอย่างมีนัยสำคัญ วิธีนี้มีความซับซ้อนมากขึ้น ทำให้เวลาที่ใช้ในการทำให้บริสุทธิ์เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าและต้นทุนเพิ่มขึ้น

3. โครมาโตกราฟีแบบแอฟฟินิตี้ + โครมาโตกราฟีแบบเซลลูโลส / โครมาโตกราฟีแบบเซลลูโลส + อัลตราฟิลเตรชัน:

- dsRNA: 0.005µg/mg ต่ำกว่าวิธีเดี่ยว

- ผลผลิต: น้อยกว่า 60-100µg

- อัตราการฟื้นตัว: ลดลง 30-40%

- การเพิ่มขั้นตอนทำให้ต้นทุนแรงงานและวัสดุเพิ่มมากขึ้น

การผลิตขนาดใหญ่

ในการผลิตขนาดใหญ่ การใช้โครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์ โครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์ร่วมกับโครมาโทกราฟีเซลลูโลส หรืออัลตราฟิลเตรชันร่วมกับโครมาโทกราฟีแบบสัมพันธ์ ผลผลิตของ mRNA ที่ขยายตัวได้เองเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเป็น 140-185µg โดยมีอัตราการฟื้นตัว 67-88% ความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์อยู่ที่ 93-94% ปริมาณ dsRNA ถูกควบคุมให้อยู่ในช่วง 0.0018-0.0020µg/mg ประสิทธิภาพการปิดฝาอยู่ที่ 96.1-96.4% และปริมาณโปรตีนตกค้างอยู่ที่ 0.04-0.05µg/mg ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการปรับขนาดและประสิทธิภาพที่ดีสำหรับการผลิตขนาดใหญ่

อ้างอิง:

[1] การตกตะกอน LiCl สำหรับการฟอก RNA ดึงข้อมูลเมื่อ 8 ม.ค. 2024 จาก https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html-

[2] แผ่นข้อมูลผลิตภัณฑ์ของสารละลายตกตะกอนลิเธียมคลอไรด์ สืบค้นเมื่อ 8 ม.ค. 2024 จาก https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf-

[3] ผลิตภัณฑ์ของ BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads สืบค้นเมื่อวันที่ 8 มกราคม 2024 จาก https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm-

[4] ผลิตภัณฑ์ของ VAHTS RNA Clean Beads ดึงข้อมูลเมื่อวันที่ 8 มกราคม 2024 จาก https://www.vazyme.com/product/215.html-

[5] การถอดรหัสและการทำให้บริสุทธิ์ของ RNA ในหลอดทดลองแบบเฟสแข็งโดยใช้ Dynabeads™ ดึงข้อมูลเมื่อวันที่ 8 มกราคม 2024 จาก https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D-

[6] ประสิทธิภาพและข้อมูล RNA Clean XP ดึงข้อมูลเมื่อวันที่ 8 มกราคม 2024 จาก https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance-

[7] ข่าวจาก ThermoFisher Scientific, สืบค้นเมื่อ 8 ม.ค. 2567 จาก https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/39287a37147e22e2d978f7dd9228df58-

[8] วิธีการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของของเหลวดิบ mRNA ที่ขยายตัวเองและการใช้งาน [P] สิทธิบัตร: CN118048418A 17.05.2024.

ข้อมูลการสั่งซื้อ

Yeasen พัฒนา CleaScrip™ T7 RNA Polymerase ใหม่ซึ่งเป็นเอนไซม์ชั้นยอดสำหรับการสังเคราะห์ mRNA เพื่อให้ไม่จำเป็นต้องใช้การบำบัดด้วยเซลลูโลสในการกำจัด dsRNA อีกต่อไป ซึ่งช่วยประหยัดทั้งเวลาและต้นทุนแรงงาน ปริมาณ dsRNA ใน mRNA ที่ผลิตโดย CleaScript™ T7 RNA polymerase ต่ำกว่าใน mRNA ที่ผลิตโดย Wild Type T7 RNA polymerase ทั้งก่อนและหลังขั้นตอนการกำจัด dsRNA โดยใช้การบำบัดด้วยเซลลูโลส ดูรายละเอียดเพิ่มเติม จากลิงค์ต่อไปนี้: