วิวัฒนาการและความสำคัญของโครงสร้างหมวกในเทคโนโลยี mRNA

โครงสร้าง Cap เป็นส่วนประกอบสำคัญในการพัฒนาวัคซีนและยา mRNA เทคโนโลยี mRNA สังเคราะห์อาศัย Cap1 เพื่อเพิ่มเสถียรภาพ ประสิทธิภาพในการแปล และลดการจดจำ mRNA โดยภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดโดยตัวรับแบบ Toll-like receptors (TLR) และเซ็นเซอร์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ ทำให้การกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่ต้องการลดลง ซึ่งจะช่วยป้องกันการตอบสนองของการอักเสบที่ไม่พึงประสงค์ จึงปรับปรุงเสถียรภาพและประสิทธิภาพของ mRNA ที่ใช้ในการรักษาในเซลล์มนุษย์

การค้นพบในระยะเริ่มต้นและโครงสร้าง Cap0

ในช่วงกลางทศวรรษ 1970 การวิจัยเกี่ยวกับ mRNA ของยูคาริโอตได้ค้นพบโครงสร้างปลาย 5' ซึ่งปัจจุบันเรียกว่า Cap0 โดยที่ N7-methylguanosine cap (m7G) เชื่อมกับนิวคลีโอไทด์ตัวแรกที่ปลาย 5' การปรับเปลี่ยนนี้พบว่าสามารถปกป้อง mRNA จากการย่อยสลายโดยเอ็กโซนิวคลีเอส ช่วยในการส่งออกนิวเคลียส และส่งเสริมการจดจำไรโบโซมเพื่อการเริ่มต้นการแปล Cap0 เป็นโครงสร้างฝาแรกที่ได้รับการระบุลักษณะ โดยเมทิลเลชันจำกัดอยู่ที่ฝากัวโนซีนเท่านั้น การค้นพบ 5'-cap นี้และหน้าที่ของมันถือเป็นความก้าวหน้าครั้งสำคัญในการทำความเข้าใจฝา mRNA ของยูคาริโอตและบทบาทของฝาเหล่านี้ในการดัดแปลง mRNA

Cap0 Structure

การเกิดขึ้นของ Cap1

โครงสร้าง Cap1 ซึ่งเป็นคุณสมบัติสำคัญของ mRNA ของยูคาริโอต มีบทบาทสำคัญในเสถียรภาพของ mRNA การแปล และการจดจำภูมิคุ้มกัน โครงสร้างแคปของ mRNA ซึ่งประกอบด้วย N7-methylguanosine (m7G) ที่เชื่อมกับนิวคลีโอไทด์ตัวแรกผ่านพันธะ 5'-5' triphosphate พัฒนาขึ้นจากการศึกษาในระยะเริ่มต้นเกี่ยวกับการดัดแปลง mRNA หลังการถอดรหัสของยูคาริโอตในช่วงทศวรรษ 1970

Cap1 Structure

โครงสร้างของ mRNA ที่ปิดปลาย 5′【1】 การศึกษาวิจัยเพิ่มเติมพบว่าใน mRNA ของยูคาริโอตส่วนใหญ่ นิวคลีโอไทด์ตัวแรกที่ตามหลังแคป (ตำแหน่ง +1) ก็จะถูกเมทิลเลชันที่ตำแหน่ง 2’-O ของไรโบสเช่นกัน ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า 2’-O-เมทิลเลชัน การค้นพบนี้ซึ่งเรียกว่าโครงสร้าง Cap1 (m7GpppNm) เพิ่มชั้นความสำคัญด้านการทำงานอีกชั้นหนึ่งให้กับการดัดแปลง mRNA การดัดแปลง Cap1 พบว่าสามารถปรับความเสถียรของ mRNA ให้ละเอียดขึ้นและป้องกันการจดจำภูมิคุ้มกันโดยระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด โดยเฉพาะในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ซึ่งจะช่วยหลีกเลี่ยงการจดจำโดยตัวรับการจดจำรูปแบบ เช่น RIG-I, TLR และ MDA5【2】 ซึ่งถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการเผาผลาญ mRNA และความก้าวหน้าของเทคโนโลยีที่ใช้ mRNA รวมถึงการฉีดวัคซีน mRNA และการใช้ยีนบำบัด

ความท้าทายทางเทคนิคในอุตสาหกรรม mRNA และวิธีแก้ไขในปัจจุบัน

ยังคงมีความท้าทายทางเทคนิคหลายประการในการใช้งานและการปรับให้วัคซีน mRNA มีประสิทธิภาพสูงสุดในวงกว้าง ซึ่งรวมถึงปัญหาเกี่ยวกับ mRNA ปริมาณสูง การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน ความเสถียร และการส่งมอบ ความท้าทายที่สำคัญในอุตสาหกรรม mRNA คือความจำเป็นในการใช้ mRNA ปริมาณสูงเพื่อกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่ง ซึ่งเกิดจากปัจจัยหลายประการ ดังนี้

การเสื่อมสภาพอย่างรวดเร็ว: mRNA นั้นไม่เสถียรโดยธรรมชาติและไวต่อการสลายตัวโดยเอนไซม์ที่ถอดฝาและไรโบนิวคลีเอส (RNases) ที่มีอยู่ในระบบทางชีววิทยา

ประสิทธิภาพการแปลที่จำกัด: ประสิทธิภาพในการแปล mRNA เป็นโปรตีนนั้นแตกต่างกันออกไป โดยต้องใช้ mRNA ในปริมาณที่มากขึ้นเพื่อสร้างระดับแอนติเจนที่เพียงพอต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ประสิทธิภาพในการแปลนั้นสัมพันธ์กับความสัมพันธ์ของ Cap1 และปัจจัยเริ่มต้นการแปล eIF4E

Translation Initiation Complex

การก่อตัวของคอมเพล็กซ์การเริ่มต้นการแปลพื้นฐานในยูคาริโอต【3】

ภูมิคุ้มกันและปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่ไม่พึงประสงค์: อุปสรรคสำคัญอันดับสามคือการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่สามารถกระตุ้นได้จาก mRNA เอง โดยเฉพาะสำหรับ dsRNA หรือ mRNA ที่ไม่สมบูรณ์ แม้ว่าจะต้องการกระตุ้นภูมิคุ้มกันในระดับหนึ่งเพื่อกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว แต่การกระตุ้นมากเกินไปอาจทำให้เกิดการอักเสบ ซึ่งอาจลดประสิทธิภาพของวัคซีนหรือทำให้เกิดผลข้างเคียงได้

ประวัติเทคโนโลยีการปิดฝา

  1. เทคโนโลยีการปิดฝาด้วยเอนไซม์: การปิดด้วยเอนไซม์ซึ่งนำมาใช้ในช่วงเริ่มต้นของการวิจัย mRNA เกี่ยวข้องกับการใช้เอนไซม์ปิด เช่น กัวนิลทรานสเฟอเรสและเมทิลทรานสเฟอเรสเพื่อเพิ่ม 5' cap ตามธรรมชาติหลังการถอดรหัส วิธีนี้ช่วยให้มั่นใจได้ถึงความเที่ยงตรงสูงและประสิทธิภาพในการปิดในการแปล mRNA โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้งานทางการรักษา

  2. อะนาล็อกของหมวกสังเคราะห์ (ช่วงปี 1980-2000): นักวิจัยได้พัฒนาแคปแอนะล็อกสังเคราะห์สำหรับการสังเคราะห์ mRNA ที่ปิดฝาในหลอดทดลอง ซึ่งช่วยศึกษาการทำงานของ mRNA และการแสดงออกของยีน Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) เป็นแคปแอนะล็อกสังเคราะห์ที่ออกแบบมาเพื่อป้องกันการรวมแคปที่ไม่ถูกต้องในระหว่างการสังเคราะห์ mRNA ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการแปลของ mRNA สำหรับวัคซีนและยีนบำบัด อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพและผลผลิตของแคปแอนะล็อก ARCA นั้นต่ำ

  3. เทคโนโลยี Cap1 (ปี 2010): วิธีการปิดฝาร่วมการถอดรหัส Cap1 ที่ทำให้กระบวนการง่ายขึ้นด้วยการรวมฝาปิดโดยตรงในระหว่างการสังเคราะห์ mRNA วิธีนี้ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพและให้ผลเป็น mRNA ที่ปิดฝาได้อย่างถูกต้องในเปอร์เซ็นต์สูง ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการประยุกต์ใช้ในการรักษาขนาดใหญ่ เช่น วัคซีน mRNA

ปัจจุบัน เทคโนโลยีการปิดฝาด้วยเอนไซม์มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาการบำบัดโดยใช้ mRNA รวมถึงวัคซีน COVID-19 โดยรับรองความเสถียรและการแปลความหมายของ mRNA ที่ใช้ในการรักษาได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การเปรียบเทียบการปิดฝาด้วยเอนไซม์รุ่นต่อไป LZCap Capping และวิธีการ Capping รุ่นแรก (ARCA)


การพัฒนา Cap Analog รุ่นต่อไป

เรามุ่งมั่นที่จะพัฒนาแคปแอนะล็อกที่มีความต้านทานต่อเอนไซม์ที่ถอดแคป มีความสัมพันธ์สูงกับ eIF4E เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการแปล และภูมิคุ้มกันที่ต่ำกว่า ความก้าวหน้าเหล่านี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการเพิ่มประสิทธิภาพของการบำบัดโดยใช้ mRNA รวมถึงการบำบัดมะเร็งและการประยุกต์ใช้ยีนบำบัด

การออกแบบ LZCap

ในการออกแบบ LZCap เราเน้นไปที่การสร้างแอนะล็อกแคปที่มีความสัมพันธ์กับ eIF4E สูง เอนไซม์มีการรับรู้ "เฉพาะ" ค่อนข้างมากต่อสารตั้งต้น ดังนั้น เมื่อออกแบบโครงสร้างแคปใหม่ เราจึงพยายามรักษาความคล้ายคลึงกับโครงสร้างตามธรรมชาติ/ที่รู้จักให้มากที่สุด โครงสร้างตามธรรมชาติมีไรโบส 3' OH ซึ่งสามารถปรับเปลี่ยนได้ (เช่น การเมทิลเลชัน) จากการพิจารณานี้ เราจึงเลือกที่จะเพิ่มคาร์บอนที่ตำแหน่ง 3' เพื่อความแปลกใหม่ ตามด้วย NH เพื่อเลียนแบบพันธะไฮโดรเจนของ OH จากนั้นจึงเพิ่มกลุ่มอะซิติลเพื่อลดความเป็นเบสของ NH และเพิ่มความสามารถในการสร้างพันธะไฮโดรเจน กิจกรรมของ LZCap ดีกว่าแคปธรรมชาติที่ถูกเมทิลเลชัน ซึ่งอาจเกิดจากพันธะไฮโดรเจนที่เพิ่มขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเมทิลและเมทอกซี กลุ่มอะซิติลอะมิโนอาจเพิ่มปฏิสัมพันธ์แบบแวนเดอร์วาลส์ระหว่างสารตั้งต้น (แคป) และปัจจัยเริ่มต้น (เอนไซม์) ได้เช่นกัน

ความคงตัวของกลุ่มอะซิติลอะมิโน

กลุ่มอะซิติลอะมิโนมีความเสถียรเพียงพออยู่แล้ว มีเสถียรภาพมากกว่าตำแหน่ง 7-เมทิลเลชันและพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ ซึ่งเป็นส่วนที่เสถียรน้อยที่สุดของแคปมาก

ผลผลิตและประสิทธิภาพการปิดฝาของ LZCap

ด้วยฝาปิด LZCap AG(3'Acm) ประสิทธิภาพการปิดฝา mRNA ของลูซิเฟอเรสอยู่ที่ประมาณ 97.59% และสามารถรับ mRNA ที่ปิดฝาได้มากถึง 200 μg ด้วยเทมเพลต DNA 1 μg ในปฏิกิริยาการถอดรหัสในหลอดทดลองมาตรฐาน (IVT) กับโพลีเมอเรส T7 RNA ความบริสุทธิ์ของ mRNA สูงถึง 99% หลังจากการตกตะกอน LiCl ธรรมดา ประสิทธิภาพการปิดฝาและผลผลิตที่สูงนี้ทำให้ LZCap เป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับการใช้งานต่างๆ รวมถึงการผลิตโปรตีนและยีนบำบัด

โครงสร้าง Cap เป็นองค์ประกอบสำคัญในการพัฒนาวัคซีน mRNA และการบำบัดรักษาเทคโนโลยี mRNA สังเคราะห์อาศัย Cap1 เพื่อเพิ่มเสถียรภาพ ประสิทธิภาพในการแปล และลดการจดจำ mRNA โดยภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดโดยตัวรับแบบ Toll-like receptors (TLR) และเซ็นเซอร์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ ทำให้การกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่ต้องการลดลง ซึ่งจะช่วยป้องกันการตอบสนองของการอักเสบที่ไม่ต้องการ จึงทำให้ mRNA ที่ใช้ในการรักษาในเซลล์มนุษย์มีเสถียรภาพและประสิทธิภาพที่ดีขึ้น

ผลิตภัณฑ์

หมวก เอจี (3'-โอ้มี-7มก)

แอลแซดแคป เอจี(3'เอซีเอ็ม)

เอจี (ไม่มีฝาปิด)

ผลผลิต mRNA (ไมโครกรัม)

164

173

200

การวิเคราะห์ MS เกี่ยวกับประสิทธิภาพการปิดฝาของ LZCapped Luciferase mRNA โดยใช้วิธี RNAse H ประสิทธิภาพการปิดฝาอยู่ที่ประมาณ 97.59%

ความเสถียรของ mRNA ต่อเอนไซม์ decapping เป็นอย่างไร

mRNA ที่มี LZCap AG(3'Acm) และ LZCap AG M6 (3'Acm) แสดงให้เห็นถึงความต้านทานต่อเอนไซม์ decapping (NEB) ที่สูงกว่า สังเกตได้ว่า CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) ยังต้านทานต่อเอนไซม์ decapping ได้ด้วย แต่ Cap AG ทั่วไป (3'-OMe-7mG) ไม่แสดงความต้านทานดังกล่าว

ความสัมพันธ์ผูกพันของ LZCap กับ eIF4E เป็นอย่างไร?

การแสดงออกของโปรตีนของ mRNA ที่ปิดฝาด้วย LZCap AG(3'Acm) เป็นอย่างไรบ้าง?

การแสดงออกของ mRNA ที่ปิดด้วยลูซิเฟอเรส LZCap AG(3'Acm) สูงกว่าการแสดงออกของ mRNA ที่ปิดด้วยลูซิเฟอเรสอนาล็อก Cap1 (3'-OMe-7mG) อย่างมีนัยสำคัญในสายเซลล์ต่างๆ* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T และ Huh7) การทดลองซ้ำ 130 ครั้งแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ mRNA ที่ปิดด้วยลูซิเฟอเรส LZCap AG(3'Acm) สูงกว่า mRNA ที่ปิดด้วยลูซิเฟอเรส (3'-OMe-7mG) ประมาณ 1.5 เท่าโดยเฉลี่ย ผลลัพธ์ที่คล้ายกันนี้พบในหนู ระดับการแสดงออกของโปรตีนอาจแตกต่างกันเล็กน้อยตามลำดับ mRNA ที่แตกต่างกัน

คุณมีข้อมูลสัตว์เพิ่มเติมไหม?

ประสิทธิภาพการแสดงออกของ LZCap AG(3'Acm) หรือ LZCap AG(3'FMom) ถูกปิด

mRNA ที่เข้ารหัส GLuc แสดงให้เห็นการแสดงออกในร่างกายที่สูงกว่าเมื่อเทียบกับ mRNA ที่ปิดฝาด้วย CapAG (3'-OMe-7mG) ในลิงแสมและหมูป่า

แล้วภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของ mRNA ที่ปิดฝาด้วย LZCap AG เป็นอย่างไรบ้าง?

mRNA ที่ปิดฝาด้วย LZCapAG (3'Acm) แสดงให้เห็นถึงภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดที่ต่ำ TLR8, TLR7, IL-1A และ B มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก RNA ที่ไม่มีฝาปิด การศึกษาวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันของ mRNA ของ LZCapped ในร่างกายแสดงให้เห็นว่า RNA ที่ไม่มีฝาปิดทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับการถอดรหัสของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันในหนู ทั้ง mRNA ที่ปิดฝาด้วย LZCap และ 3'-OMe-7mG แสดงให้เห็นระดับการถอดรหัสของปัจจัยภูมิคุ้มกันที่ต่ำกว่าที่คล้ายคลึงกันในหนูหลังจากการฉีดกระตุ้นด้วย RNA เพียงครั้งเดียว

คุณได้ทำการทดสอบความปลอดภัยบ้างหรือเปล่า?

ใช่ เราทำการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์, การศึกษาการยับยั้งโพลิเมอเรสของมนุษย์ และการทดสอบ Ames

  1. ไม่มีหรือมีพิษต่อเซลล์เพียงเล็กน้อยที่สังเกตเห็นในโมโนเมอร์นิวคลีโอไซด์ของ 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）ในเซลล์ 293T、Huh7、MRC5、THP1 และ U87MG
  2. DNA โพลีเมอเรสของมนุษย์ ( α ,β , γ และ Klenow) และการศึกษาการยับยั้งกิจกรรมของไมโตคอนเดรีย RNA โพลิเมอเรส (hPOLRMT) แสดงให้เห็นว่า 3'-Acm-7mG TP ไม่ยับยั้ง DNA ของมนุษย์หรือ RNA โพลิเมอเรส
  3. การทดสอบการกลายพันธุ์ย้อนกลับของแบคทีเรีย (Ames) ตรวจจับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้อง รวมถึงสารก่อมะเร็งที่เป็นพิษต่อพันธุกรรมในสัตว์ฟันแทะและมนุษย์ส่วนใหญ่ การทดสอบ Ames แสดงให้เห็นว่า 3'-Acm-7mG ไม่มีพิษต่อพันธุกรรม

สินค้านี้ได้รับการจดสิทธิบัตรแล้วหรือยัง?

ใช่ครับ สิทธิบัตรได้รับการอนุมัติแล้วในสหรัฐอเมริกา

ข้อมูลการสั่งซื้อ

ชื่อสินค้า ข้อมูลจำเพาะ เลขที่แคตตาล็อก
แอลแซดแคป เอจี(3'เอซีเอ็ม)（ 100 มิลลิโมลาร์ 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10684ES
แอลแซดแคป ออสเตรเลีย(3'เอซเมตร)- 100 มิลลิโมลาร์- 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10685ES
แอลแซดแคป GG(3'เอซม)（ 100 มิลลิโมลาร์ 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10686ES
แอลแซดแคป เอจี (3'Ma-Cy5) 25 มิลลิโมลาร์) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10688ES
แอลแซดแคป เอจี(3'มา-ไซ7)- 25 มิลลิโมลาร์- 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10689ES
LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 มิลลิโมลาร์) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. 10687ES
LZCap (AG(3'Ma-ไบโอติน) (25 mM) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. สอบถามเพิ่มเติม
LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. สอบถามเพิ่มเติม
LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม
LZCap (AG(3'Acm) หิ่งห้อย luc mRNA (1μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม
LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม
LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม
LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. สอบถามเพิ่มเติม
LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม
LZCap (AG(3'Acm) กลูคา mRNA (1μg/μL) 100 ไมโครลิตร, 1 มล. ฉันการสอบถาม

อ้างอิง:

  1. กลไกโมเลกุลของการปิดฝาและการเมทิลเลชัน RNA ของไวรัสโคโรนาไวรัส Virologica Sinica 31(1)
  1. วัคซีน mRNA — ยุคใหม่ของวิทยาวัคซีน เนชั่นแนล เรฟ. ดรัก. ดิสคอฟ 17, 261–279 (2018).
  2. การเริ่มต้นการแปลถูกควบคุมโดยโปรตีนที่จับกับ RNA ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: การปรับเปลี่ยนคอมเพล็กซ์การเริ่มต้นการแปลโดยปัจจัยทรานส์แอคติ้ง เซลล์ ปี 2564, 10(7), 1711

การสอบถาม