ชุดสังเคราะห์ RNA ประสิทธิภาพสูง T7 ช่วยปรับระบบปฏิกิริยาการถอดรหัสให้เหมาะสม ชุดอุปกรณ์นี้สามารถสังเคราะห์ RNA สายเดี่ยวได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้โพลีเมอเรส RNA T7, DNA สายคู่เชิงเส้นที่มีลำดับโปรโมเตอร์ T7 เป็นแม่แบบ และ NTP เป็นสารตั้งต้นเพื่อควบคุมลำดับ DNA ที่อยู่ปลายน้ำของโปรโมเตอร์ ในระหว่างการถอดรหัส สามารถเติมนิวคลีโอไทด์ที่ดัดแปลงลงในสารตั้งต้นเพื่อเตรียมไบโอตินหรือ RNA ที่ติดฉลากด้วยสีย้อม

1. การแนะนำชุดสังเคราะห์ RNA ผลผลิตสูง T7
2. หลักการของ ในหลอดทดลอง การถอดความ
3. ข้อดีของ Yeasen ชุดสังเคราะห์ RNA ประสิทธิภาพสูง T7
4. ประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์
5. วิธีการใช้งานชุดนี้
6. คำถามที่พบบ่อย
7. ข้อมูลการสั่งซื้อ

1. การแนะนำชุดสังเคราะห์ RNA ผลผลิตสูง T7

ชุดสังเคราะห์ RNA ผลผลิตสูง T7 สามารถสังเคราะห์ทั้งทรานสคริปต์ยาวและทรานสคริปต์สั้น และสามารถผลิต RNA ได้ 100-200 μg ด้วยอินพุตเทมเพลต DNA 1 μg RNA ที่สังเคราะห์สามารถใช้สำหรับแอปพลิเคชันปลายทางต่างๆ เช่น การวิจัยโครงสร้างและฟังก์ชันของ RNA การป้องกัน RNase การผสมพันธุ์แบบโพรบ การรบกวน RNA การฉีดไมโคร และอื่นๆ ในหลอดทดลอง การแปล

2. หลักการของ ในหลอดทดลอง การถอดความ

รูปที่ 1. ในหลอดทดลอง กระบวนการถอดรหัส

3. ข้อดีของ Yeasen ชุดสังเคราะห์ RNA ประสิทธิภาพสูง T7

ผลผลิตสูงมาก—มากถึง 200 µg ใน 2 ชั่วโมง
อเนกประสงค์—เหมาะสำหรับทรานสคริปต์ RNA ขนาด 20nt-10000nt
การใช้งานหลากหลาย—สร้าง RNA ที่ไม่ติดฉลาก ติดฉลาก หรือปิดฝา

4. ประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์

รูปที่ 2 การเปรียบเทียบผลผลิต IVT

หมายเหตุ: สารทำปฏิกิริยาทั้งหมดมาจาก ชุดสังเคราะห์ RNA T7 -Yeasen#10623 หรือบริษัท B*) ปฏิกิริยา IVT ให้ผลผลิตเป็น Yeasen และบริษัท B* ดังแสดงด้านบน

รูปที่ 3 คุณภาพของผลิตภัณฑ์ทรานสคริปต์สำหรับความยาวที่แตกต่างกัน

รูปที่ 4 ระดับการแสดงออกของ mRNA ที่ถอดรหัสในเซลล์ HEK-293

หมายเหตุ: mRNA ถูกปิดด้วยเอนไซม์ Vaccinia Capping (Yeasen#10614/10615)

5. วิธีการใช้งานชุดนี้

5.1 สารเคมีละลาย

ปั่นแยก T7 RNA Polymerase Mix สักครู่แล้ววางบนน้ำแข็ง ละลายบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10 เท่าและไรโบนิวคลีโอไทด์ (ATP, CTP, GTP, UTP) ผสมและปั่นแยกที่ก้นหลอด วางบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10 เท่าไว้ที่อุณหภูมิห้องแล้ววางไรโบนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดบนน้ำแข็ง

5.2 เตรียมระบบปฏิกิริยาการถอดรหัสตามตารางต่อไปนี้

ตารางที่ 1.วิธีการเตรียมระบบปฏิกิริยาการถอดรหัส

บันทึก:
ก) เตรียมปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้อง เนื่องจากบัฟเฟอร์การถอดรหัส 10 เท่ามีสเปอร์มิดีน ดังนั้นความเข้มข้นของสเปอร์มิดีนที่สูงเกินไปที่อุณหภูมิต่ำจะทำให้เกิดการตกตะกอนของเทมเพลตดีเอ็นเอ
ข) ทรานสคริปต์สั้น (<100 nt) สามารถใช้เทมเพลต 2 µg ได้ โดยเพิ่มเวลาในการถอดรหัสเป็น 4-8 ชั่วโมง
c) สำหรับการถอดรหัสที่ยาว (>1000 nt) แนะนำให้ใช้เทมเพลตพลาสมิดเชิงเส้นสำหรับการถอดรหัส
ง) ให้ทำปฏิกิริยาในเครื่อง PCR โดยเปิดฝาขณะร้อนเพื่อป้องกันไม่ให้สารละลายปฏิกิริยาระเหยเป็นเวลานาน
e) ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาอาจมีตะกอนสีขาว นี่คือแมกนีเซียมไพโรฟอสเฟตที่เกิดขึ้นจากไพโรฟอสเฟตและไอออนแมกนีเซียมอิสระระหว่างปฏิกิริยา ซึ่งจะไม่ส่งผลต่อการทดลองในขั้นถัดไป คุณสามารถเติม EDTA เพื่อกำจัดออกไปได้ หากคุณกังวลว่าการเติม EDTA จะส่งผลต่อการทดลองในขั้นถัดไป คุณสามารถแยกส่วนของเหลวส่วนบนออกได้โดยการปั่นเหวี่ยง
f) สารเคมีและภาชนะบรรจุต้องไม่มีการปนเปื้อนของ RNase

5.3 ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง

ผสมสารละลายปฏิกิริยาข้างต้น ปั่นเหวี่ยงไปที่ก้นหลอดสักครู่ แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หากความยาวของทรานสคริปต์น้อยกว่า 100 nt ให้เพิ่มเวลาปฏิกิริยาเป็น 4-8 ชั่วโมง

5.4 การบำบัดด้วย DNase I (ทางเลือก)

เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์แล้ว ให้เติม DNase I (ปราศจาก RNase) 2 μL ลงในแต่ละหลอด แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 15 นาทีเพื่อกำจัด DNA แม่แบบ

6. คำถามที่พบบ่อย

6.1 ผลผลิตของปฏิกิริยา IVT ต่ำ

คุณภาพของเทมเพลตมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับผลผลิต หากผลผลิตของกลุ่มทดลองต่ำกว่ากลุ่มควบคุมเชิงบวกอย่างมีนัยสำคัญ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ
① เทมเพลตประกอบด้วยส่วนประกอบที่จะยับยั้งปฏิกิริยา IVT
② มีบางอย่างผิดปกติกับเทมเพลต

6.2 ข้อเสนอแนะ

① ทำการทำความสะอาดเทมเพลตอีกครั้ง
② ยืนยันความเข้มข้นและความสมบูรณ์ของเทมเพลต
③ ขยายเวลาตอบสนอง
④ เพิ่มอินพุตของเทมเพลต
⑤ ลองใช้ RNA โพลิเมอเรสอื่นและโปรโมเตอร์ที่สอดคล้องกัน

6.3. ผลผลิตของการบันทึกสั้น ๆ อยู่ในระดับต่ำ

หากทรานสคริปต์เป้าหมายมีขนาดสั้นกว่า 100 nt ให้ขยายเวลาปฏิกิริยาเป็น 4-8 ชั่วโมง หรือเพิ่มอินพุตของเทมเพลตเป็น 2ug ในระบบปฏิกิริยา 20 μL

6.4 มีการบันทึกที่ยาวกว่าที่ไม่คาดคิด

หากผลลัพธ์ของอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลแสดงให้เห็นว่ามีการถอดรหัสที่ยาวกว่าที่คาดไว้ สาเหตุที่เป็นไปได้อาจเป็นดังนี้:
① เทมเพลตพลาสมิดอาจไม่ได้รับการทำให้เป็นเชิงเส้นอย่างสมบูรณ์
②เทมเพลตมีปลายที่เชื่อมติดกัน โดยมีส่วนยื่นออกมา 3 ฟุต
③ข้อความถอดความมีโครงสร้างรองที่ไม่ถูกทำลายธรรมชาติโดยสมบูรณ์

6.5 ข้อเสนอแนะ

①ตรวจสอบว่าเทมเพลตพลาสมิดได้รับการทำให้เป็นเส้นตรงอย่างสมบูรณ์หรือไม่ หากจำเป็น ให้ดำเนินการทำให้พลาสมิดเป็นเส้นตรงอีกครั้ง
②เลือกเอนไซม์จำกัดที่เหมาะสมเพื่อสร้างเทมเพลตพลาสมิดเชิงเส้นและหลีกเลี่ยงการผลิตปลายที่ยึดติดกันด้วยระยะยื่น 3' สามารถใช้ชิ้นส่วน Klenow หรือ DNA โพลิเมอเรส T4 เพื่อผลิตปลายทู่ได้หากจำเป็น
③ใช้เจลสำหรับเปลี่ยนสภาพเพื่อตรวจหาทรานสคริปต์

6.6 มีการบันทึกสั้น ๆ ที่ไม่คาดคิด

หากผลลัพธ์ของอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลแสดงให้เห็นว่ามีทรานสคริปต์ที่สั้นกว่าอย่างไม่คาดคิด สาเหตุที่เป็นไปได้อาจเป็นดังนี้:
①มีลำดับที่คล้ายคลึงกับลำดับการสิ้นสุดของโพลีเมอเรส RNA T7 ในเทมเพลต
②เนื้อหา GC ของเทมเพลตสูง

6.7 ข้อเสนอแนะ

① ลดอุณหภูมิปฏิกิริยา (เช่น 30℃) แต่โปรดทราบว่าบางครั้งการลดอุณหภูมิปฏิกิริยาอาจทำให้ผลผลิตลดลง
② ลองใช้ RNA โพลิเมอเรสอื่นเพื่อเร่งปฏิกิริยา IVT
③หากเนื้อหา GC ของเทมเพลตสูง ให้ตั้งอุณหภูมิปฏิกิริยา IVT ที่ 42℃ หรือเติม SSB ลงในระบบปฏิกิริยา IVT เพื่อเพิ่มผลผลิตและความยาวของทรานสคริปต์

6.8 เกิดการเปื้อนของทรานสคริปต์ระหว่างการวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส

หากมีการเลอะของทรานสคริปต์ระหว่างการวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส สาเหตุที่เป็นไปได้อาจเป็นดังนี้:
①มีการปนเปื้อนของ RNase ในระหว่างการดำเนินการทดลอง
②เทมเพลต DNA ถูกปนเปื้อนโดย RNases

6.9 ข้อเสนอแนะ

①ตรวจสอบให้แน่ใจว่าสารเคมีทั้งหมดได้รับการกำหนดสูตรโดยใช้ H2O ที่ปราศจาก RNase ใช้ปลายปิเปตที่ปราศจาก RNase และหลอด Eppendorf และสวมถุงมือและหน้ากากลาเท็กซ์แบบใช้แล้วทิ้งระหว่างปฏิบัติการทดลอง
② ทำการทำให้เทมเพลต DNA บริสุทธิ์อีกครั้ง

7. ข้อมูลการสั่งซื้อ

ต่อไปนี้เป็นผลิตภัณฑ์ตัวแทนที่นำเสนอโดย Yeasenมีขนาดเพิ่มเติมให้เลือก ผลิตภัณฑ์ของเราได้รับการปรับให้เหมาะสมอย่างยิ่งเพื่อทำงานร่วมกัน เพื่อช่วยให้มั่นใจถึงประสิทธิภาพและความสามารถในการทำซ้ำที่เหนือกว่า
เรายังสามารถให้บริการที่กำหนดเองได้ หากคุณสนใจผลิตภัณฑ์ที่ไม่ได้แสดงไว้ โปรดติดต่อเราและเราจะทำงานร่วมกับคุณเพื่อตอบสนองความต้องการของคุณ

ตารางที่ 2.ข้อมูลสินค้า

ในส่วนของการอ่าน:

สารเคมีเกรด GMP สำหรับการสังเคราะห์ mRNA ในหลอดทดลอง

Yeasen วัตถุดิบสังเคราะห์ mRNA ในหลอดทดลองเกรด GMP สำหรับเทคโนโลยีชีวภาพ