บทความนี้บรรยายถึงการประยุกต์ใช้ Concanavalin A และการจับคู่โควาเลนต์กับเม็ดแม่เหล็ก
ส่วนที่ 1. คอนคานาวาลิน เอ
Concanavalin A-Coated Magnetic Beads (ConA beads) เป็นเม็ดแม่เหล็กชีวภาพที่เลกตินจากพืช Concanavalin A (ConA) จับคู่กับนาโนวัสดุซูเปอร์พาราแมกเนติก ตามชื่อที่แนะนำไว้ ต่อไปนี้คือคำอธิบายสั้นๆ เกี่ยวกับ ConA Magnetic Beads
Concanavalin A (ConA) ซึ่งเป็นโปรตีนเลกตินจากพืชที่ไม่มีลักษณะเฉพาะของหมู่เลือด เป็นโปรตีนเลกตินจากพืชตัวแรกที่ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์และตกผลึกจากปลาหมึก (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2479
ConA มี 2 รูปแบบหลัก ขึ้นอยู่กับค่า pH ของสารละลายที่มันมีอยู่: โฮโมไดเมอร์ α-2 หรือโฮโมเททราเมอร์ α-4 [2]ภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง (pH>7.0) จะอยู่ในสถานะเททระเมอร์ (ประกอบด้วยซับยูนิต 4 ตัวที่มีน้ำหนักโมเลกุล 26 kDa) ภายใต้สภาวะที่เป็นกรด (pH 4.5-5.5) Con A จะแตกตัวเป็นโครงสร้างไดเมอร์ที่ถูกกระตุ้น (52 kDa) นอกจากนี้ การทำงานของ ConA ยังได้รับผลกระทบจากไอออนบวกที่มีประจุบวก 2 เช่น ในกรณีที่ไม่มีไอออนโลหะ (Ca2+ และแมงกานีส2+) ไม่สามารถบรรลุโครงสร้างและหน้าที่การจับไกลโคโปรตีนได้-1--
รูปที่ (1) การสร้างแบบจำลองโมเลกุลของ (A) โมโนเมอร์ ConA (B) ไดเมอร์ ConA (C) เททระเมอร์ ConA กับแมนโนส กลูโคส และไอออนของโลหะ
ส่วนที่ 2. ลูกปัด
ลูกปัดแม่เหล็กชีวภาพเป็นกลุ่มของไมโครสเฟียร์แม่เหล็กที่มีขนาดอนุภาคนาโนเมตร ซึ่งก่อตัวขึ้นจากพอลิเมอร์และอนุภาคนาโนแม่เหล็กอนินทรีย์ ลูกปัดแม่เหล็กสามารถจำแนกได้เป็นสามประเภทหลักตามโครงสร้าง ได้แก่ โครงสร้างแบบแกน-เปลือก โครงสร้างแบบแซนวิช และโครงสร้างแบบกระจาย วัสดุแม่เหล็กได้แก่ ผงเหล็กบริสุทธิ์ เหล็กคาร์บอนิล แร่แม่เหล็ก ออร์โธเฟอร์ไรต์ และโลหะผสมเหล็กโคบอลต์ เอตอัล-
นาโนวัสดุแม่เหล็กมีเอฟเฟกต์พิเศษ เช่น เอฟเฟกต์ขนาดเล็ก เอฟเฟกต์พื้นผิว และเอฟเฟกต์ขนาดควอนตัม เป็นต้น ซึ่งมีขนาดเท่ากับ Fe3โอ้4 อนุภาคขนาดนาโนมีขนาดเล็กกว่า 30 นาโนเมตร การรบกวนจากความร้อนภายในอนุภาคขนาดนาโนมีนัยสำคัญ และในเวลานี้ อนุภาคขนาดนาโนเหล่านี้แสดงคุณสมบัติทางแม่เหล็กพิเศษ นั่นคือ ซูเปอร์พาราแมกเนติก ซูเปอร์พาราแมกเนติก Fe3โอ้4 อนุภาคนาโนถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมทางชีวภาพ เนื่องจากมีคุณสมบัติคุณภาพสูง เช่น ปราศจากพิษ มีความเข้ากันได้ทางชีวภาพดี มีคุณสมบัติกำหนดเป้าหมายแม่เหล็กที่เป็นเอกลักษณ์ และเกิดความร้อนได้ง่ายในสนามแม่เหล็กไฟฟ้าแบบสลับ
ในทางตรงกันข้าม การมีปฏิสัมพันธ์โควาเลนต์ของ ConA กับไมโครสเฟียร์เพื่อตรึงไบโอโมเลกุลจะมีข้อดีดังต่อไปนี้:
- ความเสถียรสูงของการจับกันแบบโควาเลนต์เพื่อการทำซ้ำได้
- การจับกันของ Ligand ConA บนพื้นผิวของไมโครบีดเพื่อปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลเป้าหมาย
- การกำหนดลักษณะจลนศาสตร์ของสภาพแวดล้อมของสารละลาย เหมาะสำหรับการจัดการการทดลองทางชีววิทยา
ส่วนที่ 3. การประยุกต์ใช้ลูกปัดแม่เหล็ก ConA
ตามที่รายงานในเอกสาร การประยุกต์ใช้หลักของลูกปัดแม่เหล็ก ConA แบ่งออกเป็น 3 สถานการณ์ ได้แก่ การแยกเยื่อหุ้มไซโตพลาสซึม การเสริมไกลโคโปรตีน และการแยกลักษณะเซลล์ที่เคลื่อนที่ไม่ได้
การประยุกต์ใช้ I: การแยกเยื่อหุ้มไซโทพลาสซึม
โดยใช้ลูกปัดแม่เหล็ก ConA ที่ได้รับผลกระทบจากการกระตุ้นไอออนบวก 2 ประจุ ทำให้มีอยู่ใน Ca2+ และแมกนีเซียม2+ สภาพแวดล้อมของสารละลายซึ่งมีหน้าที่ในการโต้ตอบกันระหว่าง α-D-mannosyl และ α-D-glucosyl ที่ใช้ในการทำให้บริสุทธิ์ของเยื่อหุ้มพลาสมานั้นเป็นวิธีที่เรียบง่ายและมีประสิทธิภาพ ตัวอย่างเช่น การแยกเซลล์หรือเนื้อเยื่อออกจากเยื่อหุ้มพลาสมานั้นเป็นขั้นตอนสำคัญในการได้รับโปรตีนจากเยื่อหุ้มพลาสมาเพิ่มเติม ConA สามารถจับกับโปรตีนที่ถูกไกลโคซิเลตบนเซลล์ได้ และหลักการนี้สามารถนำมาใช้เพื่อให้ได้เยื่อหุ้มพลาสมาที่มีความบริสุทธิ์สูงขึ้น ขั้นตอนการทำงานหลัก ได้แก่ การตรึง ConA ไว้บนลูกปัดแม่เหล็กโดยการจับ ConA ที่ถูกไบโอตินิเลตเข้ากับลูกปัดแม่เหล็กสเตรปตาวิดิน การฟักเยื่อหุ้มเซลล์ด้วยลูกปัดแม่เหล็ก ConA เป็นเวลา 1 ชั่วโมง การดูดซับบนชั้นวางแม่เหล็ก การล้างด้วย TBS 5 ครั้ง และการชะสารละลายของเยื่อหุ้มไซโทพลาสมาออกด้วยสารชะ[3]-
รูปที่ 2 ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ลูกปัดแม่เหล็ก ConA สำหรับเยื่อหุ้มพลาสมา
การประยุกต์ใช้ II: การเสริมไกลโคโปรตีน
ConA มีลักษณะเฉพาะสำหรับแมนโนสและกลูโคส และรับรู้แมนโนสที่จับกับอัลฟา ซึ่งเป็น "โอลิโกแซกคาไรด์หลัก" ของไกลโคโปรตีนในซีรั่มและเยื่อหุ้มเซลล์หลายชนิด ดังนั้นจึงสามารถใช้ในทางภูมิคุ้มกันวิทยาเพื่อแยกโมเลกุลที่ถูกไกลโคซิเลต เช่น ไกลโคโปรตีนในไลเสทของเซลล์หรือเนื้อเยื่อหรือในซีรั่ม
ขั้นตอนสำคัญประการหนึ่งก็คือ โดยการเชื่อมขวางนาโนเพิร์ลแม่เหล็กอะมิโนไซลาไนซ์ (MNPs) กับ ConA ผ่านตัวเชื่อมแบบสองหน้าที่ คือ บิส-เอ็น-ไฮดรอกซีซัคซินิไมด์ลิโนเลเอต (DSS) เพื่อให้ได้เม็ดแม่เหล็ก ConA เพื่อยุติการจับแบบไม่จำเพาะของนาโนเพิร์ลแม่เหล็กโดยใช้เมทอกซีเอทิลีนไกลคอล (MEG) และเพื่อดำเนินการแยกแม่เหล็ก เพื่อเติมสารสกัดโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์ที่ย่อยด้วยทริปซินเพื่อฟักเม็ดแม่เหล็ก ConA ทั้งสองเม็ดและไกลโคเปปไทด์ที่จับได้ และสุดท้ายเพื่อชะล้างไกลโคเปปไทด์ที่จับได้ และเพื่อทำการทำให้แห้งด้วยสุญญากาศ เม็ดแม่เหล็ก ConA ทั้งสองเม็ดได้รับการฟัก เม็ดแม่เหล็ก ConA ที่มีไกลโคโปรตีนที่จับได้จะถูกเก็บรวบรวมโดยชั้นวางแม่เหล็ก ล้างส่วนที่ไม่เป็นไกลโคเปปไทด์ และสุดท้าย ไกลโคเปปไทด์ที่จับได้จะถูกชะล้างและทำให้แห้งด้วยสุญญากาศ วิธีนี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ตำแหน่งไกลโคไซเลชันเฉพาะของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก (เช่น EGFR) ได้อย่างเจาะลึก[4]-
รูปที่ 3 อนุภาคนาโนซูเปอร์พาราแมกเนติกที่จับคู่เข้ากับเลกตินที่แตกต่างกัน
การประยุกต์ใช้ III: การแยกเซลล์ที่เคลื่อนที่ไม่ได้
การใช้ลูกปัดแม่เหล็ก ConA (ลูกปัดแม่เหล็กที่จับกับ Concanavalin A ซึ่งเป็นสารคู่หูที่มีความบริสุทธิ์สูงอย่างโควาเลนต์) เพื่อจับกับไกลโคโปรตีนบนเยื่อหุ้มเซลล์หรือเยื่อหุ้มนิวเคลียส จึงสามารถจับเซลล์หรือนิวเคลียสได้ ทำให้สามารถมองเห็นการจัดการเซลล์จำนวนน้อยในเชิงทดลองได้ ตัวอย่างเช่น ลูกปัดแม่เหล็ก ConA ใช้ใน CUT&Tag และ CUT&RUN [5] การทดลองซึ่งเป็นเทคนิคใหม่ที่ใช้ในการศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของโครมาติน และจะถูกทำให้เคลื่อนที่ไม่ได้โดยการจับเม็ดแม่เหล็ก ConA เข้ากับเซลล์เพื่อสร้างภาพการทำงานและหลีกเลี่ยงปัญหาการสูญเสียเซลล์ที่เกิดจากการปั่นเหวี่ยง
เมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยี ChIP-seq แบบดั้งเดิมในการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DNA และโปรตีน CUT&Tag และ CUT&RUN จะมีข้อดีดังต่อไปนี้:
- ลูกปัดแม่เหล็ก ConA จะจับกับไกลโคโปรตีนของเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อให้มองเห็นการทำงานได้และเพิ่มประสบการณ์การปฏิบัติการทดลอง
- ไม่จำเป็นต้องปั่น เพียงแค่ดูดซับลูกปัดแม่เหล็ก ConA บนชั้นวางแม่เหล็กเพื่อแยกตัวอย่างเซลล์และสารละลายให้เสร็จสมบูรณ์
- สามารถใช้งานได้กับเซลล์เพียง 10 เซลล์ จึงไม่จำเป็นต้องใช้ตัวอย่างจำนวนมากสำหรับ ChIP-seq
รูปที่ 4 แผนผังของ ChIP-seq, CUT&Tag และขั้นตอนการทดลอง CUT RUN
ส่วนที่ 4.
ลูกปัดแม่เหล็ก ConA พัฒนาโดย
1.คุณสมบัติผลิตภัณฑ์
- การผลิตแบบแบตช์มีเสถียรภาพและการทำซ้ำผลลัพธ์ที่ดีขึ้น
- การเก็บข้อมูลประสิทธิภาพที่เสถียร
- ประสิทธิภาพการจับเซลล์>90%
2.ข้อมูลผลิตภัณฑ์
| หมายเลขแมว | แมว#19810ES |
| ขนาด | 1มล./5มล./20มล. |
| สี | สีเหลืองอมน้ำตาล |
| ความเข้มข้นของลูกปัด | 10 มก./มล. |
| เนื้อหาที่มั่นคง | 9-11 มก./มล. |
| ขนาดลูกปัด | 1 ไมโครเมตร |
| ความจุ | 105 เซลล์/ลูกปัดµL |
3.ข้อมูลประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์
(1)การกระจายตัวแบบโมโนดิสเพอร์ซิตี้
ภายใต้เงื่อนไขการบำบัดแบบเดียวกันและภายใต้กำลังขยาย 10×/40× ลูกปัด ConA จะกระจายตัวเป็นเนื้อเดียวกันโดยพื้นฐาน และไม่มีการสังเกตเห็นการรวมตัวกันที่ชัดเจนเมื่อเทียบกับคู่แข่ง
| | ลูกปัด ConA ของคู่แข่ง | |
รูปที่ 5. กราฟผลลัพธ์ของการกระจายตัวแบบโมโนดิสเพอร์ซิตี้
(2) ผลของลูกปัด ConA ที่จับกับเซลล์
เซลล์จำนวนเท่ากันถูกฟักกับลูกปัดเป็นเวลาเท่ากัน และจำนวนเซลล์ที่เหลืออยู่หลังจากการจับคู่ลูกปัด ConA จะถูกตรวจจับโดยอัตโนมัติภายใต้เครื่องวิเคราะห์เซลล์ และผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า
| การแขวนลอยของเซลล์ | เซลล์ที่เหลืออยู่หลังจากการจับกับลูกปัดแม่เหล็ก ConA แบบแข่งขัน | เซลล์ที่เหลืออยู่หลังจากการจับกันของ |
รูปที่ 6.ภาพของเซลล์ที่ผูกด้วยลูกปัดแม่เหล็ก ConA
(3) จำนวนการจับเซลล์และความสามารถในการทำซ้ำ
ทั้ง 10µL
รูปที่ 7. ผลลัพธ์ ของลูกปัด ConA ที่จับจำนวนเซลล์และอัตราการจับ
(4)เสถียรภาพการเร่งความเร็ว
จ่ายที่ 1 มล./หลอด สภาวะการจัดเก็บคือ การบำบัดเร่งที่อุณหภูมิ 4℃, 37℃ เป็นเวลา 2, 4, 7, 11 และ 14 วัน และการบำบัดทำลายที่อุณหภูมิ -20℃ เป็นเวลา 1, 3, 6 และ 8 วัน ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าภายใต้สภาวะการทดลองเดียวกัน อัตราการจับเซลล์ของผลิตภัณฑ์ที่เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4℃ การบำบัดเร่งที่อุณหภูมิ 37℃ และการบำบัดทำลายที่อุณหภูมิ -20℃ อยู่ที่ >95% และค่า CV ของการจำลองแบบทั้งสามกลุ่มภายใต้สภาวะการบำบัดแต่ละสภาวะอยู่ภายใน 1% ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดี
รูปที่ 8 ผลลัพธ์ อัตราการจับเซลล์และความลำเอียงในการทำซ้ำของลูกปัด ConA ภายใต้อุณหภูมิและเวลาที่แตกต่างกัน
ข้อมูลการสั่งซื้อ
| 19810ES |