ลูกปัดแม่เหล็กชนิดต่างๆ ใน NGS: ลูกปัดแม่เหล็ก DNA\RNA\mRNA
ลูกปัดแม่เหล็กเป็นหนึ่งในผลิตภัณฑ์ที่จำเป็นในการสร้างไลบรารีการจัดลำดับข้อมูลปริมาณมาก ลูกปัดแม่เหล็กสามารถทำความสะอาด DNA หรือ RNA คัดกรองชิ้นส่วน DNA ขนาดเป้าหมายและเพิ่มความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกเป้าหมาย ด้วยการพัฒนาเทคโนโลยีการจัดลำดับข้อมูล ลูกปัดแม่เหล็กจึงมีความเฉพาะทางในสาขาการใช้งานต่างๆ เช่น ลูกปัดแม่เหล็กทำความสะอาด DNA ลูกปัดแม่เหล็กเลือกขนาด DNA ลูกปัดแม่เหล็กทำความสะอาด RNA และลูกปัดแม่เหล็กเพิ่มความเข้มข้นของ mRNA แล้วหลักการของลูกปัดแม่เหล็กแต่ละประเภทมีอะไรบ้าง จะเลือกใช้อย่างไรดี?
ขอตัวอย่างฟรีและราคาที่ต่ำกว่าสำหรับการซื้อจำนวนมาก
1.ลูกปัดดีเอ็นเอ
2. การแนะนำลูกปัด DNA ดาว
3. เม็ดบีดฟอก RNA
4. เม็ดแม่เหล็กที่เสริมด้วย mRNA
5.
1. ดีเอ็นเอ ลูกปัด
1.1 หลักการพื้นฐาน
หลักการของการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ด้วยลูกปัดแม่เหล็กนั้นขึ้นอยู่กับการตรึงแบบย้อนกลับในเฟสของแข็ง (SPRI) ภายใต้เงื่อนไขบางอย่าง กรดนิวคลีอิกจะถูกจับกับลูกปัดแม่เหล็กอย่างเลือกสรรในขณะที่สารมลพิษยังคงอยู่ในสารละลาย หลังจากใช้สนามแม่เหล็กแล้ว ลูกปัดแม่เหล็กที่จับกับโมเลกุลเป้าหมายจะถูกแยกออกจากสารละลาย จากนั้นลูกปัดแม่เหล็กจะถูกทำความสะอาดเพื่อกำจัดสารมลพิษเพิ่มเติม เนื่องจากการรวมกันของลูกปัดแม่เหล็กและโมเลกุลกรดนิวคลีอิกนั้นย้อนกลับได้ จึงสามารถชะกรดนิวคลีอิกออกจากลูกปัดแม่เหล็กได้ด้วยบัฟเฟอร์เกลือต่ำ
พื้นผิวด้านนอกของลูกปัดแม่เหล็กถูกดัดแปลงด้วยกลุ่มฟังก์ชันซิลิกอนไฮดรอกซิลหรือคาร์บอกซิล ในระบบบัฟเฟอร์การทำให้บริสุทธิ์ที่มี PEG และไอออนเกลือสูง DNA จะถูกผูกมัดด้วยลูกปัดโดยการสร้างสะพานไอออนของกลุ่มคาร์บอกซิลไอออนเกลือของ DNA การจับกันนี้สามารถกลับคืนได้ สะพานไอออนจะถูกลบออกในบัฟเฟอร์ TE โดยไม่มี PEG และไอออนเกลือ และในที่สุด DNA จะถูกทำให้บริสุทธิ์ โดยอิงจากลูกปัดแม่เหล็กคาร์บอกซิล อินพุตลูกปัดแม่เหล็กที่แตกต่างกันและบัฟเฟอร์การทำให้บริสุทธิ์จะผูกมัดชิ้นส่วนที่มีขนาดต่างกัน ลูกปัดแม่เหล็กจะผูกมัดชิ้นส่วนขนาดใหญ่ของ DNA เป็นหลัก ดังนั้นในรอบแรก ลูกปัดแม่เหล็กจะถูกใช้ผูกมัดชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่กว่าชิ้นส่วนเป้าหมาย และของเหลวส่วนบนจะถูกเก็บไว้ ในรอบที่สอง ลูกปัดแม่เหล็กจะผูกมัดชิ้นส่วนเป้าหมายในของเหลวส่วนบน จากนั้นจึงทิ้งของเหลวส่วนบน ในที่สุด ชิ้นส่วนเป้าหมายจะถูกชะออกจากลูกปัดแม่เหล็ก ซึ่งชิ้นส่วน DNA มีขนาดเป้าหมาย
รูปที่ 1. โครงสร้างเม็ดแม่เหล็กคาร์บอกซิล
รูปที่ 2 หลักการของลูกปัดแม่เหล็กฟอก DNA
1.2 กระบวนการดำเนินการ
รูปที่ 3 ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ของ DNA
รูปที่ 4 ขั้นตอนการเลือกขนาด DNA
1.3 เคล็ดลับการใช้ลูกปัดแม่เหล็ก
ผลผลิตที่ได้รับการปรับปรุงและการเลือกขนาดที่แม่นยำ
(1) ผสมให้เข้ากันก่อนใช้และปรับสมดุล นำลูกปัดแม่เหล็กไปวางที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาอย่างน้อย 30 นาที
——ความสามารถในการละลายของ PEG ในลูกปัดแม่เหล็ก บัฟเฟอร์ได้รับผลกระทบจากค่า pH และอุณหภูมิได้ง่ายก่อนใช้งานจำเป็นต้องปรับสมดุล ถึงอุณหภูมิห้องเพื่อทำ ลูกปัดแม่เหล็กแขวนลอยอย่างสม่ำเสมอและ PEG ละลายหมดเพื่อหลีกเลี่ยงการส่งผลต่อผลการดูดซับและการแยก
(2) เวลาในการดูดซับควรเพียงพอและผสมกันอย่างเต็มที่ เพื่อให้การดูดซับมีเพียงพอ;
(3) การซักด้วยเอธานอล 80% ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์หรือแยก
——ภายใต้เอธานอล 80% กรดนิวคลีอิกจะถูกทำให้แห้งและรวมตัวกันอย่างใกล้ชิด และจะไม่ละลาย เอนไซม์ที่เหลือ บัฟเฟอร์ สิ่งเจือปน ฯลฯ ในระบบจะถูกทำความสะอาดด้วยเอธานอลเพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์มากขึ้น ห้องสมุด.
(4) ในระหว่างการเลือกขนาด ให้ยืนยันปริมาตรตัวอย่างเพื่อให้แน่ใจว่าอัตราส่วนการเพิ่มลูกปัดแม่เหล็กถูกต้อง
——ในระหว่างการเลือกขนาด จำเป็นต้องป้อนปริมาตรของลูกปัดแม่เหล็กที่สอดคล้องกันอย่างแม่นยำ เพื่อให้สัดส่วนมีความแม่นยำ เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของ PEG และความเข้มข้นของไอออนเกลือในบัฟเฟอร์อาจส่งผลกระทบต่อผลลัพธ์
(5) ก่อนขั้นตอนการสกัด ให้ปล่อยให้แอลกอฮอล์ระเหยจนหมดก่อน ป้องกันลูกปัดจาก การทำให้แห้งเกินไป
——โดยทั่วไปสามารถทำให้แห้งได้ภายใน 2~3 นาที เมื่อจำนวนลูกปัดแม่เหล็กมีขนาดใหญ่และแห้งยาก ขอแนะนำให้ใช้งานกับหลอดเหวี่ยงหลายหลอด
(6) หากลูกปัดแม่เหล็กถูกรวมเป็นกลุ่มหรือเป็นแผ่น เวลาการชะออก สามารถขยายได้ หลังจากผสมเสร็จเรียบร้อยแล้ว;
——อาจเกิดจาก สิ่งเจือปนในดีเอ็นเอหรือ เวลาอบแห้งนานเกินไป โดยทั่วไป เมื่อมีสิ่งเจือปนใน DNA มากเกินไป แนะนำให้ทำการทำให้บริสุทธิ์ก่อน ก่อน การเลือกขนาด
2. การแนะนำลูกปัด DNA ดาว
ลูกปัดคัดเลือก DNA ของ Hieff NGS™ ยึดตามหลักการ SPRI (การตรึงแบบย้อนกลับของเฟสแข็ง) โดยใช้วัตถุดิบลูกปัดแม่เหล็กนำเข้า และระบบบัฟเฟอร์ที่ปรับให้เหมาะสม ซึ่งสามารถใช้สำหรับการคัดเลือกขนาดชิ้นส่วน DNA และการทำให้บริสุทธิ์ในระหว่างการสร้างคลัง NGS ลูกปัดนี้ใช้ในลักษณะเดียวกับลูกปัด AMPure XP ที่ใช้ และประสิทธิภาพการกู้คืนชิ้นส่วนและการกระจายขนาดคลังก็สอดคล้องกันอย่างมาก
2.1 การแนะนำประสิทธิภาพการฟอก
- ระบบบัฟเฟอร์เฉพาะตัว: ชิ้นส่วน DNA ลงไป สามารถกู้คืน 50bp ได้
- อัตราการฟื้นตัวสูง: ≥90%
- ขจัดสิ่งสกปรกได้อย่างมีประสิทธิภาพ: ขจัดสิ่งสกปรก เช่น ไพรเมอร์ไดเมอร์ dNTP เกลืออนินทรีย์ และโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- ขอบเขตการใช้งานกว้าง: เหมาะสำหรับการชำระ DNA ในสถานการณ์ต่างๆ เช่น การย่อยเอนไซม์ การผูก การโคลน และการสร้างห้องสมุด NGS
ตารางที่ 1. ประสิทธิภาพการฟอก DNA และการกู้คืนของลูกปัดแม่เหล็กที่มีอัตราส่วนต่างกัน
| กลุ่มประสบการณ์ | ความเข้มข้นของการกู้คืนลูกปัดแม่เหล็กในชุดนี้ (ng/μL) | อัตราการฟื้นตัว | กลุ่มลูกปัด AMPure XP (ng/μl) ④ | อัตราการฟื้นตัว | ร้อยละ CV | |||
| อัตราส่วน | ① | ② | ③ | เฉลี่ย | ||||
| 1.8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96.92% | 22.2 | 94.37% | 2.55% |
| 0.8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82.19% | 17.8 | 75.67% | 6.52% |
| 0.6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42% | 16.2 | 68.87% | 2.55% |
รูปที่ 5. ผลการทดลองการฟอกของอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรสด้วยลูกปัดแม่เหล็ก
M：บันได DNA ขนาด 1kb;
2.2 ประสิทธิภาพการเลือกขนาด
- ง่าย ถึง การดำเนินการ: หลักการแยกและการดำเนินการทดลองมีความสอดคล้องอย่างสมบูรณ์กับลูกปัดแม่เหล็ก XP
- การเลือกขนาดที่แม่นยำ: ขนาดของชิ้นส่วนที่เรียงลำดับมีความแม่นยำและมีเสถียรภาพ
- สามารถใช้งานได้หลากหลาย: เหมาะสำหรับ อาคาร ห้องสมุด DNA และ RNA และการปรับตัว เพื่อเลือกขนาดชิ้นส่วนของประเภทตัวอย่างต่างๆ
- ประสิทธิภาพต้นทุนที่สูงเป็นพิเศษ: คุณภาพมีเสถียรภาพ ราคาประหยัดยิ่งขึ้น การบริการก่อนและหลังการขายที่ใส่ใจมากขึ้น
รูปที่ 6 ผลการเลือกขนาด DNA
3. เม็ดบีดฟอก RNA
น้ำยาทำความสะอาด RNA ของ Hieff NGS™ ยึดตามหลักการ SPRI ซึ่งสามารถกำจัดโปรตีน ไอออนเกลือ และสิ่งเจือปนอื่นๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อให้ได้ตัวอย่าง RNA เข้มข้นที่มีความบริสุทธิ์สูง และปรับระบบบัฟเฟอร์กรดอย่างระมัดระวังเพื่อรักษาเสถียรภาพของโครงสร้าง RNA และป้องกันการย่อยสลายของ RNA เหมาะสำหรับการสร้างไลบรารี RNA การทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่าง RNA ทั้งหมดหลังจากการกำจัด rRNA การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ RNA ที่ถอดรหัสในหลอดทดลอง การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ที่มีฉลาก RNA การทำให้บริสุทธิ์ของ RNA สังเคราะห์ เป็นต้น
- คุณภาพสูง: วัตถุดิบนำเข้า คุณภาพมีเสถียรภาพสูง
- ระบบบัฟเฟอร์ที่ปรับให้เหมาะสม: รับประกันความบริสุทธิ์และความสมบูรณ์ของ RNA และป้องกันการย่อยสลายของ RNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- ประสิทธิภาพสูง: การกู้คืนที่มีประสิทธิภาพ เหมาะสำหรับการสร้างคลัง RNA หรือในหลอดทดลอง การกู้คืนผลิตภัณฑ์การถอดรหัส ฯลฯ
รูปที่ 7 อิเล็กโทรโฟเรโตแกรมของตัวอย่างต่างๆ หลังจากการฟอก
4. เม็ดแม่เหล็กที่เสริมด้วย mRNA
4.1 หลักการแยก mRNA
ลูกปัดแม่เหล็กสำหรับแยกและเพิ่มความเข้มข้นของ mRNA คือลูกปัดแม่เหล็กที่ปรับเปลี่ยนพื้นผิวด้วยโอลิโก (dT) โดยอาศัยหลักการไฮบริดิเซชัน ลูกปัดแม่เหล็กสามารถจับ mRNA กับหางโพลีเอโดยเฉพาะ และแยก mRNA ออกจาก RNA ทั้งหมดหรือเซลล์เนื้อเยื่อโดยเฉพาะ ชุดทดสอบนี้ซึ่งมีสูตรผลิตภัณฑ์ที่ปรับให้เหมาะสมสามารถแยก mRNA ที่สมบูรณ์และมีความบริสุทธิ์สูงจาก RNA ของเซลล์และเนื้อเยื่อของสัตว์ พืช แมลง และจุลินทรีย์ยูคาริโอตได้อย่างมีประสิทธิภาพ
รูปที่ 8.หลักการเสริมสมรรถนะและการทำให้บริสุทธิ์ของลูกปัดแม่เหล็ก mRNA
4.2 ประสิทธิภาพของลูกปัดแยก mRNA
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit ได้รับการพัฒนาโดยอิสระโดย
- ประสิทธิภาพสูง: การทำให้บริสุทธิ์ mRNA สามารถเสร็จสิ้นภายใน 45 นาที
- ความบริสุทธิ์สูง: ลูกปัดแม่เหล็กโอลิโก (dT) จับกับ mRNA โดยเฉพาะ
- เชื่อถือได้: mRNA ที่ได้นั้นเหมาะสมกับ NGS ในหลอดทดลอง การแปล RT-PCR และการสังเคราะห์ cDNA
รูปที่ 9 ชุดแยก mRNA การทำให้บริสุทธิ์ของ mRNA จากตัวอย่าง RNA ที่แตกต่างกัน
หมายเหตุ: ผลผลิตยีนดูแลบ้านแสดงถึงผลของการกู้คืน mRNA ผลผลิตยีนที่เกี่ยวข้องกับ rRNA การวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของประสิทธิภาพการกำจัด rRNA
4.3 คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับลูกปัดแม่เหล็ก mRNA
(1) ทำไมลูกปัดแม่เหล็กจึงเกาะกลุ่มกันและจะแก้ไขอย่างไร?
——ลูกปัดแม่เหล็ก การเกาะกลุ่มกันจะทำให้ผลผลิตและความบริสุทธิ์ของ mRNA ลดลง ตัวอย่างอาจมีสิ่งเจือปนอยู่มากมาย เช่น โพลิแซ็กคาไรด์ โปรตีน และดีเอ็นเอสายยาว สิ่งเจือปนเหล่านี้จะทำให้เกิดลูกปัดแม่เหล็ก การรวมตัวกัน วิธีแก้ปัญหาคือเป่าลูกปัดแม่เหล็กผ่านปิเปต สามารถกำจัด DNA ของจีโนมออกได้ด้วยการรักษาด้วย DNase ก่อนการทำให้บริสุทธิ์ หากขนาดตัวอย่างเริ่มต้นมีขนาดใหญ่เกินไปและเกินภาระของลูกปัดแม่เหล็ก ลูกปัดแม่เหล็กจะรวมตัวเป็นก้อนเช่นกัน ขอแนะนำให้ใช้งานตามปริมาณอินพุตในคู่มือ
(2) ทำไมผลผลิต mRNA ถึงต่ำ?
——มีหลายสาเหตุที่ทำให้ผลผลิต mRNA ต่ำ:
- ระดับการแสดงออกของ mRNA ของเซลล์หรือเนื้อเยื่อนั้นต่ำ ดังนั้นเราจึงสามารถเลือกตัวอย่างช่วงการแสดงออกที่เหมาะสมหรือเพิ่มปริมาณอินพุต RNA รวมของตัวอย่างได้อย่างเหมาะสม
- อัตราส่วนของลูกปัดแม่เหล็กต่อตัวอย่างต่ำเกินไป ซึ่งส่งผลต่อการรวมกันของ mRNA และลูกปัดแม่เหล็ก พยายามเพิ่ม จำนวนลูกปัดแม่เหล็กหรือลดปริมาณและปริมาตรของอินพุตตัวอย่าง
- เวลาในการผสมพันธุ์สั้นเกินไป เวลาในการฟักตัวอาจเพิ่มเป็น 10-15 นาทีได้
- การชะล้างไม่เพียงพอ จำเป็นต้องเพิ่มปริมาตรของบัฟเฟอร์การชะล้างอย่างเหมาะสม เพิ่มเวลาและอุณหภูมิการชะล้าง หรือทำซ้ำขั้นตอนการชะล้างสองครั้ง
(3) กำจัด rRNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพได้อย่างไร?
——หากการดำเนินการไม่ถูกต้อง rRNA จะถูกจับแบบไม่จำเพาะกับลูกปัดแม่เหล็กพร้อมกับ mRNA ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ โดยเฉพาะเมื่อมีปริมาณอินพุต RNA ทั้งหมดจำนวนมาก กระบวนการทำให้บริสุทธิ์โดยปกติจะใช้การผูกมัดสองรอบ เพื่อหลีกเลี่ยงมลภาวะ rRNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ต้องแน่ใจว่าผสมกันอย่างเต็มที่ระหว่างการทดลองการซักเพื่อขจัดการจับแบบไม่จำเพาะและพยายามขจัดการปนเปื้อนของ rRNA
(4) สำหรับแอปพลิเคชันปลายทางจำนวนมาก จำเป็นต้องชะ mRNA หรือไม่ และลูกปัดแม่เหล็กจะรบกวนปฏิกิริยาเอนไซม์ปลายทางหรือไม่
——ปฏิกิริยาต่อเนื่องบางอย่างสามารถดำเนินการได้โดยตรงกับลูกปัดแม่เหล็กโดยไม่ต้องชะ mRNA ออก เช่น การแบ่งส่วนของ mRNA และการถอดรหัสย้อนกลับในการสร้างคลัง RNAอย่างไรก็ตาม หากต้องดำเนินการปฏิกิริยา PCR จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อน DNA ของจีโนม มิฉะนั้น ชิ้นส่วนการขยายจีโนมจำนวนมากจะถูกสร้างขึ้น ซึ่งจะรบกวนผลการทดลอง สามารถดำเนินการโดยละเอียดได้ตามคำแนะนำของปฏิกิริยาต่อเนื่องที่เกี่ยวข้อง เช่น การสร้างไลบรารี RNA-Seq
(5) ชุดทดสอบสามารถแยก mRNA ออกจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อโดยตรงได้หรือไม่?
——ไม่แนะนำ! ไลเสทประกอบด้วยส่วนประกอบบางอย่างที่จะส่งผลต่อการจับของ mRNA แนะนำให้ใช้ชุดพิเศษ
5. Yeasen แนะนำสินค้าลูกปัดแม่เหล็ก
ลูกปัดแม่เหล็กซีรีส์ Hieff NGS™
ตารางที่ 2.
| ชื่อสินค้า | แมว# | ข้อมูลจำเพาะ | การใช้งานและสถานการณ์การใช้งาน |
| ไฮเอฟเอ็นจีเอส™ ลูกปัดคัดแยกดีเอ็นเอ | 12601ES03 | 1 มล. | 👉เอ็นจีเอส ดีเอ็นเอ การฟอกและการเลือกขนาด 👉การทำให้บริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR 👉การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์การย่อยและการผูกเอนไซม์ |
| 12601ES08 | 5 มล. | ||
| 12601ES56 | 60 มล. | ||
| 12601ES75 | 450 มล. | ||
| ไฮเอฟเอ็นจีเอส™ น้ำยาทำความสะอาด อาร์เอ็นเอ | 12602ES03 | 1 มล. | 👉การทำให้บริสุทธิ์ของ RNA 👉การทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่าง RNA ทั้งหมดหลังจากการกำจัด rRNA 👉การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ที่มีฉลาก RNA |
| 12602ES08 | 5 มล. | ||
| 12602ES56 | 60 มล. | ||
| 12602ES75 | 450 มล. | ||
| ชุดมาสเตอร์แยก mRNA Hieff NGS™ | 12603ES24 | 24 ต | 👉การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ mRNA 👉การถอดรหัส mRNA ในหลอดทดลอง |
| 12603ES96 | 96ต |
เรื่องการอ่าน
คุณมีความรู้เกี่ยวกับเทคโนโลยีที่เกี่ยวข้องกับ NGS มากเพียงใด?
5 นาทีเพื่อทำความเข้าใจอดีตและปัจจุบันของลูกปัดคัดเลือก DNA (รวมถึงการวิเคราะห์ผลและการตีความคำถามที่พบบ่อย)