ชุดวิเคราะห์เศษ DNA ของเซลล์โฮสต์ HEK293 ได้รับการออกแบบมาเพื่อ การวิเคราะห์เชิงปริมาณของชิ้นส่วน DNA ที่เหลือของ HEK293 ที่มีความยาวต่างๆ ในสารตัวกลาง ผลิตภัณฑ์กึ่งสำเร็จรูป และผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของการเตรียมทางชีวภาพ ชุดนี้ใช้หลักการโพรบฟลูออเรสเซนซ์ qPCR เพื่อตรวจจับเศษ DNA ที่เหลือของ HEK293 ได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจงทั้งที่ต่ำกว่าและมากกว่า 200 เบสคู่ โดยมีขีดจำกัดการวัดปริมาณที่ต่ำถึง 10 fg/μL นอกจากนี้ยังมี HEK293 DNA Control (ข้อมูลอ้างอิงเชิงปริมาณ DNA) อีกด้วย ชุดนี้สามารถใช้ร่วมกับชุดเตรียมตัวอย่าง DNA ที่เหลือจากลูกปัดแม่เหล็กของบริษัทได้ (แมว#18461ES/18462ES)

ข้อมูลสินค้า

ส่วนประกอบ

การจัดเก็บและการจัดส่ง:

1. ส่วนประกอบทั้งหมดจะถูกจัดส่งบนน้ำแข็งแห้ง และควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -25°C ถึง -15°C เมื่อได้รับสินค้า อายุการเก็บรักษาคือ 2 ปี ส่วนประกอบ A และ B1, B2, B3 และ B4 ควรเก็บให้พ้นจากแสง

2. เมื่อได้รับแล้ว ตรวจสอบว่ามีส่วนประกอบครบทั้ง 7 ชิ้น และจัดเก็บในอุณหภูมิที่แนะนำทันที

ข้อควรระวัง:

1. ผลิตภัณฑ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยเท่านั้น

2. ด้วยเหตุผลด้านความปลอดภัยและสุขภาพ โปรดสวมเสื้อคลุมห้องปฏิบัติการและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้งระหว่างปฏิบัติการ

3. ก่อนใช้สารเคมีนี้ โปรดอ่านคู่มือการใช้งานอย่างละเอียด การทดลองควรดำเนินการตามขั้นตอนมาตรฐาน รวมถึงการจัดการตัวอย่าง การเตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยา และการปิเปต

4. ควรผสมส่วนประกอบแต่ละส่วนให้เข้ากันโดยการเขย่าเบาๆ และปั่นสักครู่ก่อนใช้งาน

เครื่องมือที่เข้ากันได้:

รวมถึงแต่ไม่จำกัดเฉพาะเครื่องดนตรีต่อไปนี้: เทอร์โมไซแอนทิฟิค: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus- Bio-Rad: โมดูลออปติก CFX96- เทคโนโลยีการแพทย์ Shanghai Hongshi: SLAN-96S

คำแนะนำการใช้งาน

1. การเจือจางของสารอ้างอิงเชิงปริมาณควบคุม DNA HEK293 และการเตรียมกราฟมาตรฐาน

ชุดวิเคราะห์เศษส่วน HEK293 ประกอบด้วยเศษส่วนการขยายสัญญาณ 4 ส่วนที่มีความยาวต่างกัน ได้แก่ 82 bp, 133 bp, 227 bp และ 515 bp เมื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน ให้สร้างเส้นโค้งแยกกันสำหรับแต่ละเศษส่วนการขยายสัญญาณ และคำนวณปริมาณที่เหลือและการกระจายสัมพันธ์ตามเส้นโค้งมาตรฐานที่สอดคล้องกัน

ใช้บัฟเฟอร์เจือจาง DNA ที่ให้มาในชุดเพื่อเจือจาง HEK293 DNA Control Quantitative Reference ในระดับไล่ระดับ ความเข้มข้นในการเจือจางควรเป็นดังนี้: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL และ 30 fg/μL-

โดยมีรายละเอียดดังนี้

1-วางบัฟเฟอร์ควบคุม DNA และเจือจาง DNA HEK293 จากชุดทดสอบบนน้ำแข็งเพื่อละลาย หลังจากละลายหมดแล้ว ให้ปั่นเบาๆ เพื่อผสมและปั่นเหวี่ยงสั้นๆ (10 วินาที) เพื่อรวบรวมสารละลายที่ก้นหลอด

2-เตรียมหลอดเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด จำนวน 6 หลอด แล้วติดฉลากเป็น Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 และ Std5

3-ในหลอดที่มีฉลากว่า Std0 ให้เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL และ HEK293 DNA Control 10 μL เพื่อให้ได้ความเข้มข้น 3 ng/μL ปั่นเบาๆ เพื่อผสมและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ (10 วินาที) สามารถแบ่งความเข้มข้นนี้และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C ได้สำหรับการใช้ระยะสั้น (นานถึง 3 เดือน) หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

4- ในหลอดทดลองที่มีฉลากว่า Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 และ Std5 ให้เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL ในแต่ละหลอดก่อน ขั้นตอนการเจือจางแต่ละขั้นตอนควรผสมเบาๆ และปั่นเหวี่ยงสั้นๆ เพื่อให้แน่ใจว่ามีความสม่ำเสมอ จากนั้นทำการไล่ระดับ การเจือจางดังนี้:

ตารางที่ 1: การเจือจางแบบไล่ระดับมาตรฐาน

- สำหรับความเข้มข้นแต่ละค่า ให้ทำซ้ำ 3 ครั้ง รีเอเจนต์นี้สามารถทดสอบได้ในช่วงเชิงเส้นตั้งแต่ 300 pg/μL ถึง 30 fg/μL หากจำเป็น สามารถขยายหรือจำกัดช่วงเชิงเส้นให้เหมาะสมได้

- เพื่อลดรอบการแช่แข็ง-ละลายซ้ำๆ และหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน ขอแนะนำให้แบ่งส่วนและจัดเก็บการวัดปริมาณ DNA สมาตรฐานที่ -20°C สำหรับการใช้งานครั้งแรก

- DNA ที่เจือจางและละลายแล้วสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C ได้นานถึง 7 วัน หากไม่ได้ใช้เป็นเวลานาน ให้เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C

- เพื่อให้แน่ใจว่าเทมเพลตผสมกันหมด ให้เขย่าส่วนผสมเจือจางแต่ละแบบเบาๆ เป็นเวลาประมาณ 1 นาที

2. การเตรียมตัวอย่างทดสอบ (TS)

เตรียมตัวอย่างทดสอบ TS ตามการตั้งค่าการทดลองดังต่อไปนี้:

1) นำตัวอย่างทดสอบ 100 μL เติมลงในหลอดเซนตริฟิวจ์ที่สะอาดขนาด 1.5 มล. ติดฉลากว่า TS ทำการเตรียมตัวอย่างล่วงหน้า และเตรียมตัวอย่างโอ้ เพียวริฟและ ตัวอย่างการทดสอบ

2) เพื่อตอบสนองความต้องการในการวิเคราะห์ความยาวส่วนขยายที่แตกต่างกันสี่แบบพร้อมกัน ปริมาณตัวอย่างทดสอบที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าควรอยู่ที่ ≥120 μL ดังนั้นขอแนะนำให้เตรียมหลอดทดลองของแต่ละตัวอย่าง 2 หลอดสำหรับการบำบัดล่วงหน้า และหลังจากสกัดแล้ว ให้ผสมเข้าด้วยกันเพื่อใช้งาน

3. การเตรียมการควบคุมการสกัดเชิงลบ (NCS)

เตรียม NCS ควบคุมการสกัดเชิงลบตามการตั้งค่าการทดลองดังต่อไปนี้:

1) นำสารละลายเมทริกซ์ตัวอย่าง 100 μL (หรือการเจือจาง DNA บัฟเฟอร์) แล้วเติมลงในหลอดเซนตริฟิวจ์สะอาดขนาด 1.5 มล. ติดฉลากว่า NCS

2) ดำเนินการเตรียมตัวอย่างเบื้องต้นของ NCS ควบคุมเชิงลบร่วมกับชุดตัวอย่างทดสอบ และเตรียมสารละลาย NCS ควบคุมเชิงลบที่บริสุทธิ์

3) เพื่อตอบสนองความต้องการในการวิเคราะห์ความยาวส่วนขยายที่แตกต่างกันสี่แบบพร้อมกัน ปริมาณตัวอย่าง NCS ที่ผ่านการบำบัดล่วงหน้าควรอยู่ที่ ≥120 μL ดังนั้น ขอแนะนำให้เตรียมตัวอย่าง NCS แต่ละหลอด 2 หลอดสำหรับการบำบัดล่วงหน้า และหลังจากสกัดแล้ว ให้ผสมเข้าด้วยกันเพื่อใช้งาน

4. การจัดทำแบบควบคุมแบบไม่ใช้เทมเพลต (NTC)

เตรียมการควบคุม NTC แบบไม่มีเทมเพลตตามการตั้งค่าการทดลองดังนี้:

1) ไม่มีการควบคุมเทมเพลต (NTC) ไม่จำเป็นต้องมีตัวอย่าง การรักษาเบื้องต้น และสามารถเตรียมได้ตั้งแต่ขั้นตอนการตรวจหาปริมาณ DNA ตกค้างด้วย qPCR

2) สำหรับหลอดทดลองหรือหลุมแต่ละหลุม ตัวอย่าง NTC ประกอบด้วยส่วนผสม 20 μL (เช่น ส่วนผสม qPCR HEK293 15 μL + ส่วนผสมไพรเมอร์และโพรบ HEK293 5 μL ที่เกี่ยวข้อง) + บัฟเฟอร์เจือจาง DNA 10 μL แนะนำให้เตรียมไว้เพียงพอสำหรับหลุมจำลอง 3 หลุม

5. ระบบปฏิกิริยา qPCR

โต๊ะ 2- ระบบการตอบสนอง สำหรับ เศษส่วน 82 bp

โต๊ะ 3- ระบบการตอบสนอง สำหรับ 133 ชิ้นส่วน bp

โต๊ะ 4- ระบบการตอบสนอง สำหรับ 227 ชิ้นส่วนบีพี

โต๊ะ 5- ระบบการตอบสนอง สำหรับ 515 ชิ้นส่วนบีพี

- เพื่อคำนวณปริมาณรวมของการผสมที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยานี้โดยอิงตามจำนวนหลุม:

ส่วนผสม = (จำนวนหลุมปฏิกิริยา + 2) × (15 + 5) μL (เพื่อชดเชยการสูญเสียหลุม 2 หลุม) โดยทั่วไปจะเตรียมหลุมจำลอง 3 หลุมสำหรับแต่ละตัวอย่าง

- จำนวนหลุมปฏิกิริยา = (หลุมเส้นโค้งมาตรฐานของการไล่ระดับความเข้มข้น 5 หลุม + 1 หลุมควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต (NTC) + 1 หลุมควบคุมเชิงลบ (NCS) + ตัวอย่างการทดสอบ N (TS)) × 3

NTC (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต): บัฟเฟอร์เจือจาง DNA

NCS (สารละลายควบคุมเชิงลบ): สารละลายเมทริกซ์ตัวอย่างหรือบัฟเฟอร์เจือจาง DNA หลังจากการเตรียมตัวอย่าง-การรักษา เพื่อให้ได้สารละลายบริสุทธิ์ซึ่งก็คือ NCS

TS (Test Sample) : ตัวอย่างที่ต้องการทดสอบ

***หลังจากจ่ายตัวอย่างและปิดผนึกหลอดแล้ว ให้ปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำ (10 วินาที) เพื่อรวบรวมของเหลวจากผนังหลอดไปยังก้นหลอด จากนั้นปั่นด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์เป็นเวลาอย่างน้อย 5 วินาทีเพื่อผสมให้เข้ากัน จากนั้นปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำอีกครั้ง (10 วินาที) หากมีฟองอากาศ ให้กำจัดฟองอากาศออก

ตาราง 6: เค้าโครงแผ่นอ้างอิง

ตัวอย่างนี้ แสดงเป็นขั้นตอนการตรวจจับ qPCR สำหรับวิเคราะห์ชิ้นส่วนการขยายของ DNA HEK293 ที่เหลืออยู่ตัวอย่างการทดสอบประกอบด้วย: กราฟมาตรฐาน DNA HEK293 ที่มีความเข้มข้น 5 ระดับ ตัวอย่างการทดสอบ 1 ตัวอย่าง (TS) สารละลายควบคุมเชิงลบ 1 ตัวอย่าง (NCS) และสารละลายควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต 1 ตัวอย่าง (NTC) ขอแนะนำให้รันหลุมจำลอง 3 หลุมสำหรับแต่ละตัวอย่าง

6. พารามิเตอร์โปรแกรมขยาย (Tสาม-วิธีขั้นตอน) (ตัวอย่างการใช้เครื่องมือ ABI 7500 qPCR ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 2.0)**

1) สร้างโปรแกรมว่างใหม่และเลือก "การวัดเชิงสัมบูรณ์" เป็นเทมเพลตการตรวจจับ

2) สำหรับความยาวชิ้นส่วนการขยายสี่แบบที่แตกต่างกัน ให้สร้างโพรบการตรวจจับใหม่ โดยตั้งชื่อว่า "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227"และ “HEK293-515"เลือกฟลูออโรโฟร์สำหรับรายงานผลเป็น "FAM" และฟลูออโรโฟร์สำหรับดับเป็น "none" ตั้งค่าสีย้อมอ้างอิงสำหรับการตรวจจับเป็น "ROX" (อาจเพิ่มหรือไม่เพิ่มสีย้อมอ้างอิงก็ได้ ขึ้นอยู่กับรุ่นเครื่องมือและปัจจัยอื่นๆ)

3) ในแผง "กำหนดเป้าหมายให้กับหลุมที่เลือก" ให้ตั้งค่าฟิลด์ "งาน" สำหรับหลุมโค้งมาตรฐานเป็น "มาตรฐาน" และกำหนดค่าที่สอดคล้องกันในฟิลด์ "ปริมาณ" เป็น "300000"-30000"-3000"-300"-30" (แสดงความเข้มข้นของ DNA ต่อหลุม ในหน่วย fg/μL) ตั้งชื่อหลุมในช่อง "ชื่อตัวอย่าง" เป็น "300 pg/μL" "30 pg/μL" "3 pg/μL" "300 fg/μL" "30 fg/μL" สำหรับหลุม NTC ให้ตั้งค่า "Task" เป็น "NTC" สำหรับหลุม NCS และ TS ให้ตั้งค่า "Task" เป็น "Unknown" และตั้งชื่อหลุมเป็น "NCS" และ "TS" ในช่อง "ชื่อตัวอย่าง" หลังจากตั้งค่าพารามิเตอร์เหล่านี้แล้ว ให้คลิก "Start Run" เพื่อเริ่มการทำงานของเครื่องมือ

4) การตั้งค่าโปรแกรมการขยาย: ตั้งค่าโปรแกรมการขยาย 3 ขั้นตอน โดยมีปริมาตรปฏิกิริยา 30 μL

โต๊ะ7. ขั้นตอนการทำ PCR

7. การวิเคราะห์ผล qPCR

1) ในแผง "การวิเคราะห์" ภายใต้ "พล็อตการขยาย" ระบบจะตั้งค่า "เกณฑ์" โดยอัตโนมัติ บางครั้ง "เกณฑ์" เริ่มต้นจะอยู่ใกล้กับเส้นฐานมากเกินไป ส่งผลให้ค่า Ct แตกต่างกันอย่างมากระหว่างการจำลอง คุณสามารถปรับ "เกณฑ์" ด้วยตนเองไปยังตำแหน่งที่เหมาะสม และคลิก "วิเคราะห์" ในจุดนี้ คุณสามารถตรวจสอบเส้นโค้งการขยายใน "พล็อตหลายองค์ประกอบ" เบื้องต้นได้เพื่อดูว่าเป็นปกติหรือไม่

2) ในแผง "การวิเคราะห์" ภายใต้ "กราฟมาตรฐาน" คุณสามารถอ่านค่า R² ของกราฟมาตรฐาน ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ (Eff%) ความลาดชัน และค่าตัดขวาง สำหรับกราฟมาตรฐานปกติ: R² > 0.99 ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ (90% ≤ Eff% ≤ 110%) และความลาดชันระหว่าง -3.6 และ -3.1

3) ในแผง "การวิเคราะห์" ภายใต้ "ดูตารางบ่อน้ำ" คุณสามารถอ่านคอลัมน์ "ปริมาณ" สำหรับการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต (NTC) การควบคุมเชิงลบ (NCS) และตัวอย่างทดสอบ (TS) โดยใช้หน่วยเป็น fg/μL หน่วยเหล่านี้สามารถแปลงได้ในภายหลังในรายงาน

4) การตั้งค่าพารามิเตอร์สำหรับการวิเคราะห์ผลลัพธ์ควรขึ้นอยู่กับรุ่นเครื่องมือและเวอร์ชันซอฟต์แวร์เฉพาะ โดยปกติ เครื่องมือสามารถตีความผลลัพธ์ได้โดยอัตโนมัติ

5) ค่า Ct ของตัวควบคุมเชิงลบ (NCS) ควรมากกว่าค่า Ct เฉลี่ยของความเข้มข้นต่ำสุดของเส้นโค้งมาตรฐาน

6) ผลลัพธ์ของการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต (NTC) ควรเป็น "ไม่ถูกกำหนด" หรือมีค่า Ct ≥ 32

เอกสาร

คู่มือ