1 Genetikomisinin etki prensibi

Genetomycin (Geneticin, G418), prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde 70S ve 80S ribozomlarına bağlanarak peptit zincirinin uzamasını engelleyerek protein sentezini engelleyen bir aminoglikozid antibiyotiktir. Bu mekanizma, bakteri, maya, bitki ve memeli hücreleri gibi hücreler için toksiktir. Hücreler başarılı bir şekilde transfekte edildiğinde ve neomisin direnç geni (örneğin neo geni) ile entegre edildiğinde, gen tarafından kodlanan aminoglikozid fosfotransferaz (APH (3) II), G418'i kovalent olarak modifiye ederek etkisiz hale getirebilir ve böylece G418 içeren seçici ortamda yetiştirilen hücrelere direnç kazandırabilir.

Moleküler genetik testlerde stabil transfeksiyon için sıklıkla kullanılanlardan biri de G418'dir.

2 Geneomisin uygulaması

2.1 Stabil Transfekte Hücre Hatlarının Taranması

• G418, protein sentezini inhibe ederek direnç genleri (örneğin, neo genleri) içeren hücreleri taramak için kullanıldı. Direnç geni tarafından kodlanan aminoglikozid fosfotransferaz, G418'i inaktive ederek hücreye G418'e karşı direnç kazandırır. Tipik olarak, memeli hücre tarama aralığı 200 – 2000 μg/mL'dir ve en yaygın kullanılan çalışma konsantrasyonu 100 – 700 μ g/mL'dir. Bitki hücreleri 10-100 μg/mL ve maya hücreleri 500-1000 μ g/mL olduğunda, referans olarak G418 kullanılarak bazı hücre tipleri için kullanılan konsantrasyonlar şunlardır.

Hücre	Başvuru	Geneomisin aktivasyon konsantrasyonu (μg/mL)	Alıntı yapılan eserler
Mucor türleri	a) Büyüme ortamında kültüre edilmiş b) Liyofilize edilmiş bakteriler üzerinde kültürlendi	a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL	Hirth ve diğerleri, Ulusal Bilimler Akademisi Bil. v. 79, 7356-7360 (1982).
Memeli	a) Tarama için b) Büyümeyi sürdürmek için	a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/mL	Kenani ve Berg, Ulusal Bilimler Akademisi Bil. v. 79, 5166-5170 (1982).
Bitki	a) Tarama için b) Büyümeyi sürdürmek için	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL	Ursic ve diğerleri, Biyokimya. Biyofiz. Araştırma Komisyonu, ayet 101:3, 1031-1037 (1981).
Maya	a) Tarama için b) Büyümeyi sürdürmek için	a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL	Jiménez ve Davies, Doğa, v. 287, 869-871 (1980).
Bakteriler	Tarama için	16 μg/mL	Waitz ve diğerleri, Antimikrobiyal.Ajanlar Kemoterapi., ayet 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Gen Nakavtı ve Gen Transferi

• Gen nakavtında, G418 hedef geni başarıyla nakavt eden hücreleri taramak için kullanılabilir. Gen transferinde, G418 yabancı genlerin konakçı hücrelerin genomuna entegre edilmesini kolaylaştırır.

2.3 Hücre Kültüründe Direnç Seçimi

• Hücre kültürü sırasında G418, genellikle spesifik direnç genleri taşıyan antibiyotiğe dirençli hücreleri taramak için kullanılır.

Geneomisin için ilgili 3 deneysel prosedür

3.1 G418 Stok Çözeltisinin Hazırlanması (50 mg/mL, Aktif Konsantrasyon)

1) Aktivite Birimlerinin Dönüştürülmesi

Formülü kullanarak dönüştürün: (1000/A0) × A1 = A2, burada A0, partiye göre değişen G418'in gücüdür. İlgili partinin kalite kontrol raporuna veya şişedeki etikete bakın. A1, hazırlanması gereken G418'in istenen aktif konsantrasyonudur. A2, tartılması gereken gerçek toz-hacim konsantrasyonudur.

Örneğin, G418 partisinin potansiyeli 750 U/mg ise ve 50 mg/mL'lik bir aktif konsantrasyon hazırlamak istiyorsanız, hazırlanacak gerçek toz konsantrasyonu 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL'dir.

10 mL G418 stok solüsyonu (aktif konsantrasyon, 50 mg/mL) hazırlanıyorsa, 666,7 mg toza ihtiyaç vardır.

• Sterilizasyon ve Depolama

Yukarıdaki dönüşümden elde edilen gerçek toz ağırlığına göre, tamamen çözünmesi için 10 mL steril deiyonize suya ilave edin.

Öncelikle, 0,22 μm'lik bir şırınga filtresini 5 mL steril deiyonize su ile önceden ıslatın ve tüm suyu çıkarın. Daha sonra bu filtreyi kullanarak filtreleyin ve tek kullanımlık küçük hacimlere bölün (örneğin, 1 mL) ve 1 yıllık stabilite için -20°C'de saklayın.

3.2 Kill Eğrisinin Oluşturulması

1) Birinci gün: Dönüştürülmemiş hücreleri uygun kültür plakalarına %20-25 hücre yoğunluğunda yerleştirin ve 37°C'de CO2'de bir gece inkübe edin.₂.

2) Hücre tipine göre uygun bir aralıkta konsantrasyon gradyanı ayarlayın, en az 6 konsantrasyon seçin (G418 bölünme aşamasındaki hücrelere karşı en aktiftir, bu nedenle hücreler G418 eklenmeden önce bir süre kültüre edilmelidir), örneğin memeli hücreleri için 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL olarak ayarlayın.

3) İkinci gün: Eski kültür ortamını çıkarın ve yerine, her konsantrasyon için üç tekrar olacak şekilde, ilacın karşılık gelen konsantrasyonunu içeren taze hazırlanmış ortam koyun.

4) Her 3-4 günde bir taze ilaç içeren besiyeri ile değiştirin.

5) Transfekte edilmemiş hücrelerin büyümesini önleyen uygun konsantrasyonu belirlemek için sabit aralıklarla (örneğin, her 2 günde bir) canlı hücre sayımları gerçekleştirin. Kararlı transfekte edilmiş hücre hattı taraması için çalışma konsantrasyonu olarak, ideal gün sayısı (genellikle 7-10 gün) içinde hücrelerin çoğunu öldürebilecek en düşük konsantrasyonu seçin.

3.3 Kararlı Transfekte Hücrelerin Taranması

• Yisheng Biotech tarafından sağlanan G418 Geneticin (60220ES), ≥720 U/mg etkinliğe, ~%98 saflığa ve parti stabilitesine sahiptir ve fiyatı diğer şirketlerin G418 ürünlerinin yaklaşık üçte biri kadardır.
• İlaçların bulunduğu tarama besiyeri her 3-4 günde bir değiştirildi.
• Hücre klonlarının (kolonilerin) oluşumu, seçimden 7 gün sonra gözlemlendi ve değerlendirildi. Kolonilerin oluşması, konak hücre tipine, transfeksiyona ve tarama etkinliğine bağlı olarak bir hafta veya daha fazla sürebilir.
• 5-10 dirençli klon seçilip 35 mm hücre kültürü plakalarına aktarıldı ve 7 gün boyunca ilaç içeren tarama besiyerinde tutuldu.
• Normal ortam kültürünü değiştirdikten sonra.

4 Ürün önerisi

G418 Geneticin (60220ES) Yeasen tarafından sağlanmıştır Biotech'in etkinliği ≥720 U/mg, saflığı ~%98 ve parti stabilitesi vardır; fiyatı ise diğer şirketlerin G418 ürünlerinin yaklaşık üçte biri kadardır.

Şartname	S*	T*	Yeasen	Yeasen avantajı
İçerik (HPLC)	/	/	~%98	Yüksek saflık
Potens (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Yüksek etkililik
Fiyat($/5 gr)	~1000	~1000	~200	Ucuzluk

5 Deneysel Vaka

E. coli'de G69 ve G99 iki farklı partiydi; genomisinin konsantrasyonları sırasıyla 8 mg/L, 12 mg/L ve 16 mg/L idi ve etkili minimum konsantrasyon 16 mg/L olup, çeşitli bakterilerin büyümesini tamamen engelledi.