Aureobasidin A nedir
Aureobasidin A (AbA), güçlü antifungal özelliklere sahip ve düşük konsantrasyonlarda (0,1-0,5 μg/mL) maya için toksik olabilen filamentöz mantar Aureobasidium pullulans No. R106'dan izole edilen bir siklik peptit antibiyotiktir. AbA'nın etki mekanizması, mayada AUR1 geni tarafından kodlanan bir enzim olan inositol fosforilseramid sentaz (IPC sentaz) aktivitesinin inhibisyonu yoluyla gerçekleşir ve seramidden inositol fosfolipitlere sentezi bloke ederek sfingolipit eksikliğine, hücre zarının yırtılmasına ve böylece suşun ölmesine yol açar. AbA'ya duyarlı mantar türleri arasında Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans ve A. niger bulunur.
Şekil 1 AbA'nın yapısal formülü, CAS#127785-64-2
Araştırmalar, Saccharomyces cerevisiae'nin AUR1 geninin ve Aspergillus nidulans'ın AURA geninin homolog olduğunu ve her ikisinin de IPC sentazını kodladığını bulmuştur. Bu nedenle, bu iki gendeki mutasyonlar, mutasyona uğramış AUR1-C geni gibi suşlara karşı güçlü AbA direnci sağlayabilir. AbA, pozitif klonları taramak için bir ilaç seçimi belirteci olarak çok uygundur ve çok düşük bir arka planla durum optimizasyonu gerektirmez. AbA direnci ayrıca maya tek/çift hibrit çalışmaları için ideal bir raporlayıcıdır ve karşılık gelen direnci taşıyan maya hibrit sistemleriyle uyumludur.
Maya Tek/Çift Hibrit Sistemi Nedir?
Maya iki melez sistemi (Maya iki melez testi), ökaryotik transkripsiyonel regülasyonun özelliklerine dayanarak Fields ve Song ve diğerleri tarafından yaratılmıştır. Bilinen proteinler arasındaki etkileşimleri hızlı ve doğrudan analiz edebilir ve antijen-antikor etkileşimlerinin incelenmesinde, yeni proteinlerin ve yeni protein fonksiyonlarının keşfinde, ilaç hedeflerinin taranmasında ve genomik protein bağlantı haritalarının oluşturulmasında yaygın olarak kullanılır. Maya iki melezinin prensibi, ökaryotların transkripsiyonel aktivatörünün iki farklı yapısal alan içermesidir: DNA bağlanma alanı (DNA bağlanma alanı, DNA-BD) ve DNA transkripsiyon aktivasyon alanı (Aktivasyon alanı, AD), bunlar birbirlerinin işlevini etkilemeden bağımsız olarak ayrılabilir. BD ve AD tek başlarına transkripsiyonel yanıtı aktive edemez, yalnızca ikisi yeterince mekansal olarak yakın olduğunda, tam bir transkripsiyonel aktivatörün aktivitesini sergiler ve aşağı akış geninin transkripsiyonuna izin verir. Çalışılan iki proteinin (protein X ve protein Y) sırasıyla BD ve AD domainlerine sahip füzyon plazmidleri oluşturularak ve bunlar aynı maya hücresinde ifade edilerek, iki protein arasında etkileşim yoksa, haberci gen transkripsiyonu gerçekleşmeyecektir; eğer iki protein etkileşime girerse, BD ve AD domainleri uzaysal olarak yakın olacağından, haberci gen transkripsiyonu gerçekleşmiş olacaktır.
Şekil 2 Maya iki hibritinin temel diyagramı [1]
Maya tek-hibrit teknolojisi, maya iki-hibrit temelinde geliştirilen nükleik asit-protein etkileşimlerini incelemek için bir araçtır ve bilinen DNA ile bilinen proteinler arasında bir etkileşim olup olmadığını belirlemek; hedef cis-düzenleyici elemana veya diğer kısa DNA bağlanma bölgelerine bağlanan yeni proteinleri izole etmek; etkileşime girdiği kanıtlanmış DNA bağlanma bölgelerini doğru bir şekilde bulmak ve proteinlerin DNA bağlanma bölgelerini analiz etmek gibi ökaryotik hücrelerde genlerin ifade düzenlenmesini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Temel ilkesi, bilinen cis-etkili elemanı en temel promotörün (minimal promotör, Pmin) yukarı akışında inşa etmek ve muhabir geni Pmin'in aşağı akışına bağlamaktır. Test edilecek transkripsiyon faktörünü kodlayan cDNA, maya AD alanı ifade vektörüyle birleştirilir ve maya hücrelerine sokulur.Bu genin ürünü eğer cis-etkili elemente bağlanabilirse, Pmin promotörünü aktive ederek, haberci genin ifade edilmesini sağlayabilir.
Şekil 3 Maya tek-hibritinin prensip diyagramı [2]
Maya tek/çift hibrit çalışmaları için Yeasen ürün sunmaktadır 60231ES Aureobasidin A (AbA), %97'den fazla saflıkta ve 1 mg/mL konsantrasyonda metanolde çözülmüş bir AbA çözeltisi. Yeasen, maya tek/çift hibrit deneylerinde 100-1000 ng/mL'lik bir AbA inhibitör konsantrasyonu önermektedir ve özgül çalışma konsantrasyonu, konak hücrelerinin duyarlılığına bağlıdır (aşağıdaki tabloya bakın, Çeşitli maya suşları için AbA'nın Minimum inhibitör konsantrasyonları (MİK)).
| Bfiziksel gerginlik | MİKROFON (Ngr/mL) | |
| S. cerevisiae'ler | ATCC9763 (diploit) | 200-400 |
| SH3328 (haploit) | 100 | |
| Sake mayası (diploit) | 100-200 | |
| Şoçu mayası (diploit) | 100 | |
| Bira mayası (triploid veya tetraploid) | 100 | |
| Fırıncı mayası (diploit) | 200-400 | |
| Şizofren.pombe | JY-745 (monoploid) | 100 |
| C.albicans | TIMM-0136 (diploit) | 40 |
| C. tropicalis | TIMM-0324 (diploit) | 80 |
Uygulama Durumu
GmSAGT1 geninin promotöründeki GmWRKY31 proteininin bağlanma bölgesini incelemek için, maya tek melez deneyinde, hedef DNA dizisi, AUR1-C geninin yukarısında bulunan urasil haberci geni Ura3'ü içeren pBait-AbAi vektörüne yerleştirildi. Mayanın karşılık gelen plazmidle transformasyonundan sonra, %0,9 NaCl çözeltisinde süspanse edildi ve OD600 0,005'e ayarlandı. Daha sonra, 100 μL örnek, 500 ng/mL AbA içeren plakalara yayıldı, ters çevrildi ve 3-5 gün boyunca 30℃'de kültürlendi[3].
Şekil 3 GmWRKY31 proteininin F16, F20, F73, delF16, delF20 veya delF73 parçalarını içeren maya suşlarıyla etkileşimi.
Reaktiflerimizle yayınlanan makaleler
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, ve diğerleri. Azot, Pirinçte Çiçeklenme Zamanını ve Azot Kullanım Verimliliğini Çiçek Düzenleyicileri Aracılığıyla Düzenler, Güncel Biyoloji, Cilt 31, Sayı 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (EĞER:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu ve diğerleri. Lotusta gölge kaynaklı çiçeklenmenin erken sonlandırılmasının NnSnRK1 merkezli düzenleyici ağı, Çevresel ve Deneysel Botanik, Cilt 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (EĞER:5.7)
İlgili Ürünler
| Ürün adı | Kedi# | Şartname |
| Siprofloksasin hidroklorür | 60201ES05/25/60 | 5/25/100 gr |
| Ampisilin, Sodyum Tuzu | 60203ES10/60 | 10/100 gr |
| Doksisiklin hidroklorür | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gr |
| Kloramfenikol, USP Sınıfı | 60205ES08/25/60 | 5/25/100 gr |
| Kanamisin Sülfat | 60206ES10/60 | 10/100 gr |
| Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorür (USP) | 60212ES25/60 | 25/100 gr |
| Vankomisin Hidroklorür | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamisin Sülfat Tuzu | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gr |
| Spektinomisin Hidroklorür | 60215ES08 | 5 gr |
| Fleomisin (çözeltide 20 mg/mL) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blastisidin S (Blastisidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nistatin | 60219ES08 | 5 gr |
| G418 Sülfat (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 gr |
| Puromisin (Çözelti 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL |
| Puromisin Dihidroklorür | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 gr |
| Higromisin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 gr (20 mL)/10×1 gr (20 mL) |
| Higromisin B | 60225ES03/10 | 1/10g |
| Eritromisin | 60228ES08/25 | 5/25 gr |
| Zamanlama | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2 gr |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polimiksin B Sülfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |
Referans dokümantasyonu
[1] Paiano A, ve diğerleri. Etkileşen Proteinleri Belirlemek İçin Maya İki Hibrit Testi. Güncel Protoc Protein Bilimi. 2019 Şubat;95(1):e70.
[2] John S, ve diğerleri. Maya tek hibrit denemeleri: tarihsel ve teknik bir bakış açısı. Yöntemler. 2012 Ağustos; 57(4): 441-447.
[3] Dong H, ve diğerleri. Peronospora manshurica enfeksiyonuna yanıt olarak soya fasulyesi WRKY TF'lerinin transkriptom analizi. Genomik. 2019 Aralık;111(6):1412-1422.