1 Birction ilkesi

Higromisin B, Streptomyces hygroscopicus'un metabolizması tarafından üretilen, translokasyonu bozarak ve 80S ribozomlarının yanlış okunmasını teşvik ederek protein sentezini inhibe eden, böylece prokaryotik ve ökaryotik hücreleri öldüren bir aminoglikozit antibiyotiktir.

Günümüzde higromisin direnç geni içeren prokaryotik veya ökaryotik hücrelerin taranması ve bakımı amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır.

2 Uygulama

2.1 Hph ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş prokaryotik veya ökaryotik hücrelerin (bitki hücreleri ve memeli hücreleri) taranması ve kültürünün sürdürülmesi+vektörler

Higromisin B Escherichia coli'den elde edilen direnç geni (hyg veya hph). higromisin B'yi biyolojik olarak inaktif fosforile edilmiş bir ürüne dönüştüren ve böylece detoksifiye eden higromisin B fosfotransferazını kodlar. Bu prensip göz önüne alındığında, higromisin B, higromisin direnç geni ile başarılı bir şekilde transfekte edilmiş kültürlü prokaryotik veya ökaryotik hücreleri taramak ve korumak için çok yararlı bir seçilebilir belirteçtir.

2.2 Etki mekanizmasındaki farklılık nedeniyle higromisin B, iki farklı vektörle stabil transfekte edilmiş hücre hatlarını taramak için sıklıkla genetiğin G418, bleomisin ve blastisidin ile birlikte kullanılır.

Higromisin B'nin G418'den (Cat#60220ES) ve Bleomisin'den (Cat#60257ES) farklı bir etki mekanizması vardır ve Blasticidinler (Kat#60218ES) olduğundan, çift seleksiyon deneylerinde diğer seçici antibiyotiklerle kombinasyon halinde kullanılmaya oldukça uygundur.

2.3 Antiviral ajan
2.4 Antihelmintik olarak hayvan yemlerine katılarak hayvan besleniyor.
2.5 Stabil transfekte edilmiş hücrelerin taranması

Stabil transfektanları taramak için kullanılan higromisin B'nin çalışma konsantrasyonu hücre tipine, ortama, büyüme koşullarına ve hücre metabolizma hızına bağlı olarak değişir. Önerilen konsantrasyon 50-1000 μg/mL'dir. Deneysel sistemin ilk kullanımı için, bir öldürme eğrisi, yani bir doz-cevap eğrisi oluşturularak optimum tarama konsantrasyonunun belirlenmesi önerilir. Genel olarak, memeli hücreleri için 50-500 μg/mL; bakteri/bitki hücreleri için 20-200 μg/mL; mantarlar için 200-1000 μg/mL.

3 Protokol

3.1 Depolama solüsyonunun hazırlanması (50 mg/mL)

0,5 g higromisin B tartın ve 10 mL 1×PBS, pH 7,4 ekleyin. Tamamen çözüldükten sonra sterilizasyon için 0,22 μm filtre ile süzün. Sterilize edilmiş çözeltiyi alikotlayın ve -20℃'de saklayın.

3.2 Yaygın olarak kullanılan tarama konsantrasyonu

Stabil suşların taranması için higromisin B'nin çalışma konsantrasyonu hücre tipine, kültür ortamına, büyüme koşullarına ve hücre metabolizma hızına göre değişir. İlk kez optimum tarama konsantrasyonunu belirlemek için bir öldürme eğrisi (doz-cevap eğrisi) oluşturulması önerilir. Genellikle memeli hücreleri: 50-500 μg/mL; Bakteriyel/bitki hücreleri: 20-200 μg/mL; Mantarlar: 300-1000 μg/mL.

3.3 Öldürme eğrisinin oluşturulması

【Not】Stabil hücre hatlarını taramak için, transfekte edilmemiş konak hücrelerini öldürebilen antibiyotiklerin minimum konsantrasyonunu belirlemek gerekir. Bu, bir öldürme eğrisi (doz-tepki eğrisi) oluşturularak elde edilebilir. En az beş konsantrasyon ayarlanmalıdır.

1) 1. Gün: Dönüştürülmemiş hücreler, %20-25 hücre yoğunluğunda uygun bir kültür plakasına yerleştirilir ve bir gece boyunca kültüre edilir.【Not】Canlılığı tespit etmek için daha yüksek yoğunluk gerektiren hücreler için aşılama hücrelerinin miktarı artırılabilir.

2) Konsantrasyon gradyanını hücre tipine göre uygun aralıkta ayarlayın. Memeli hücresi 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL olarak ayarlayabilir. Higromisin B solüsyonunu 1:10 oranında deiyonize su veya PBS tamponu ile 5 mg/mL'ye seyreltin. Daha sonra solüsyonu aşağıdaki tabloya göre ilgili çalışma konsantrasyonuna seyreltin.

Son Konsantrasyon (μg/mL)	Orta Hacim (mL)	5 mg/mL Higromisin B'nin Eklenme Hacmi (mL)
50	9.9	0,1
100	9.8	0,2
250	9.5	0,5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) 2. Gün: İlacın karşılık gelen konsantrasyonunu içeren taze hazırlanmış bir ortamla değiştirin. Her konsantrasyon için üç paralel örnek yapın.

4) İlaç içeren besiyerlerini 3-4 günde bir yenisiyle değiştirin.

5) Canlı hücre sayımları, transfekte edilmemiş hücrelerin büyümesini önlemek için uygun konsantrasyonu belirlemek üzere sabit bir döngüde (örneğin, her 2 günde bir) gerçekleştirilir. Kararlı hücre hattını taramak için çalışma konsantrasyonu olarak, ideal gün sayısı (genellikle 7-10 gün) içinde hücrelerin çoğunu öldüren minimum konsantrasyonu seçin.

3.4 Stabil transfekte hücrelerin taranması

1) Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreler, uygun konsantrasyonda (doğrudan veya seyreltilmiş) higromisin B içeren tarama ortamıyla alt kültüre alındı. 【Not】Antibiyotikler aktif olarak bölünen hücrelerde en iyi şekilde çalışır. Hücreler çok yoğunsa, antibiyotik hücreleri öldürmez. Hücreleri, hücrelerin %25'ten fazla birleşmeyecek şekilde bölün.

2) Tarama ortamını 3-4 günde bir değiştirin.

3) Taramadan 7 gün sonra hücre koloni oluşumunu ölçün. Koloni oluşumu konak hücre tipine, transfeksiyona ve tarama etkinliğine bağlı olarak bir hafta veya daha fazla sürebilir.

4) 5-10 dirençli klon seçilip 35 mm hücre kültürü plakalarına aktarılır ve 7 gün boyunca ilaç içeren tarama ortamında kültüre edilir.

5) Kültür için ilaçsız taze besiyeri ile değiştirin.

4 Özellikler

Higromisin B, beyazdan sarımsı kahverengiye kadar değişen renkte, özel kokulu bir tozdur, su, metanol, etanol vb.'de kolayca çözünür ve birçok organik ve inorganik asitle kolayca tuz oluşturur.

5 Ürün depolama

Çözelti doğrudan 2~8℃'de saklanabilir ve 6 aydan uzun süre saklanabilir.

6 Dikkat

1) hph geni ile transfekte edilen hücreler higromisine dirençlidir ve transfekte edilen hücreler geni stabil veya geçici olarak ifade eder.

2) E. Coli'ye ek olarak Streptomyces hygroscopicus ve Klebsiella pneumoniae gibi diğer suşlarda da higromisin B direnç geni (hyg veya hph) bulundu.

7 Ürün önerisi

Yeasen sağlar Higromisin B iki formdadır: toz (1 g/10 g, Kat#60225ES) ve çözelti (50 mg/mL, Kat#60224ES).

Ürün adı	Kedi#	Şartname
Higromisin B (50 mg/mL)	60224ES03	1 gr (20 mL)
	60224ES10	10×1 gr (20 mL)
Higromisin B	60225ES03	1 gr
	60225ES10	10 gr

Reaktiflerimizle yayınlanmış 8 makale

[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C ve diğerleri. PTPS, Bölümlere Ayrılmış LTBP1 S-Nitrozilasyonunu Kolaylaştırır ve Hipoksi Altında Tümör Büyümesini Teşvik Eder. Mol Hücresi . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (EĞER:14.548)

[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX ve diğerleri. Dinamik kromatin durum profili, filiz rejenerasyonunda oksinin ve sitokineinin düzenleyici rollerini ortaya koymaktadır. Dev Hücresi . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (EĞER:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. Arabidopsis vejetatif sürgün tepesinin tek hücreli analizi. Dev Hücresi . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (EĞER:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Kromatin Erişilebilirlik Dinamikleri ve Bitki Somatik Embriyogenezisi için Hiyerarşik Transkripsiyonel Düzenleyici Ağ Yapısı. Dev Hücresi . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (EĞER:10.092)

[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY ve diğerleri. Genom çapında CRISPR/Cas9 taraması, glioblastomada radyasyon direncinden sorumlu olan CARHSP1'i belirler. Hücre Ölümü Bozukluğu . 2021;12(8):724. 2021 Temmuz 21'de yayınlandı. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (EĞER:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, ve diğerleri. Metformin Direnciyle İlgili Prostat Kanseri Geninde Genom Ölçekli CRISPR-Cas9 Transkripsiyonel Aktivasyon Taraması. Ön Hücre Dev Biol . 2021;8:616332. 26 Ocak 2021'de yayınlandı. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (EĞER:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, ve diğerleri. Glikozdan biyobazlı süksinik asidin yüksek verimli üretimi için Yarrowia lipolytica taşıyıcılarının mühendisliği. Biyoteknoloji Biyoyakıtlar . 2021;14(1):145. 27 Haziran 2021'de yayınlandı. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (EĞER:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. α-farnesene üretimi için yağlı maya Yarrowia lipolytica'nın mühendisliği. Biyoteknoloji Biyoyakıtlar . 2019;12:296. 23 Aralık 2019'da yayınlandı. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (EĞER:5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, ve diğerleri. Tek Bir Transkripsiyon Faktörünün, Ant1'in Manipüle Edilmesi, Arpa Tanelerinde Antosiyanin Birikimini Teşvik Ediyor. J Tarım Gıda Kimyası . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (EĞER:5.279)

[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, ve diğerleri.Yarrowia lipolytica'da Kararlı ve Epizomal Ekspresyon için Mitokondriyal Replikasyon Kökeninin Tanımlanması ve Karakterizasyonu. ACS Sentezleyici Biyolojik . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (EĞER:5.110)

9 İlgili Ürünler

Ürün adı	Kedi#	Şartname
Siprofloksasin hidroklorür	60201ES05/25/60	5/25/100 gr
Ampisilin, Sodyum Tuzu	60203ES10/60	10/100 gr
Doksisiklin hidroklorür	60204ES03/08/25	1/5/25 gr
Kloramfenikol, USP Sınıfı	60205ES08/25/60	5/25/100 gr
Kanamisin Sülfat	60206ES10/60	10/100 gr
Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorür (USP)	60212ES25/60	25/100 gr
Vankomisin Hidroklorür	60213ES60/80/90	100mg/1g/5g
Gentamisin Sülfat Tuzu	60214ES03/08/25	1/5/25 gr
Spektinomisin Hidroklorür	60215ES08	5 gr
Fleomisin (çözeltide 20 mg/mL)	60217ES20/60	20/5×20mg
Blastisidin S (Blastisidin)	60218ES10/60	10/10×10mg
Nistatin	60219ES08	5 gr
G418 Sülfat (Geneticin)	60220ES03/08	1/5 gr
Puromisin (Çözelti 10 mg/mL)	60209ES10/50/60/76	1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL
Puromisin Dihidroklorür	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500 mg / 1 gr
Higromisin B (50 mg/mL)	60224ES03	1 gr (20 mL)/10×1 gr (20 mL)
Higromisin B	60225ES03/10	1/10g
Eritromisin	60228ES08/25	5/25 gr
Zamanlama	60230ES07/32	3.2/10×3.2 gr
Aureobasidin A (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1mg
Polimiksin B Sülfat	60242ES03/10	1/10MU