Apoptozis genel olarak hücrelerin gelişimi sırasında veya bazı faktörlerin etkisi altında hücre içi genlerin ve ürünlerinin düzenlenmesi yoluyla gerçekleşen bir tür programlanmış hücre ölümünü ifade eder. Apoptozis embriyonik gelişim ve morfogenezde, dokulardaki normal hücre popülasyonlarının stabilitesinde, vücudun savunmasında ve bağışıklık tepkisinde, hastalık veya zehirlenmeden kaynaklanan hücre hasarında ve yaşlanmada ve tümörlerin oluşumunda ve ilerlemesinde önemli bir rol oynar ve potansiyel terapötik öneme sahiptir.

Apoptotik yoldaki olaylar bir zaman dizisi içerisinde gerçekleşir, yani olaylar birbiri ardına gerçekleşir ve sonunda apoptotik cisimlerin ortaya çıkmasıyla apoptozis meydana gelir.

Tipik özellikleri şunlardır:

1. Erken apoptozis: hücre zarı yapısında değişiklikler, fosfatidilserin eversiyonu;

2. Erken ve orta evre apoptozis: Sitoplazma yoğunluğu artmış, mitokondriyal membran potansiyeli kaybolmuş, geçirgenlik değişmiş ve sitokrom C sitoplazmaya salınmıştır;

3. Geç apoptozis: apoptozis sinyal iletimi;

4. Geç apoptoz: DNA 180~200bp parça boyutuna kadar parçalanmıştır.

Şekil 1: Apoptozis yolunda ardışık olayların meydana gelmesi ve tespiti

1. Erken apoptozis: Annexin-V/PI çift ​​boyama (ekstraselüler membranda PS tespiti)

Normal canlı hücrelerde fosfatidilserin (PS) hücre zarının iç tarafında bulunur. Apoptozis meydana geldiğinde hücre zarı değişir ve PS hücre zarının iç yüzeyinden hücre zarının dış yüzeyine döner. Annexin-V, 35-36 KD moleküler ağırlığa sahip, yüksek afiniteyle PS'ye bağlanabilen Ca2+ bağımlı bir fosfolipit bağlayıcı proteindir. Florescein (FITC, Alexa fluor488, vb.) ile işaretlenmiş Annexin-V'yi bir prob olarak kullanarak, apoptotik hücreler ve canlı hücreler akış sitometrisi veya floresan mikroskobu ile tanımlanabilir.

Nekrotik hücrelerin PS'si de hücre zarının iç yüzeyinden hücre zarının dış yüzeyine doğru dönecektir. Annexin-V ayrıca nekrotik hücrelerin yüzeyindeki PS'yi tanıyabilir, bu nedenle Annexin-V nekrotik hücreleri apoptotik hücrelerden ayırt edemez. Ek olarak, propidin iyodür (PI), hücrelerdeki DNA'ya bağlanabilen bir nükleik asit boyasıdır ve hücre zarının tamamına nüfuz edemez. Erken apoptotik hücrelerin ve canlı hücrelerin hücre zarı hala sağlamdır ve PI boyası hücre zarından hücreye serbestçe girip DNA ile bağlanamaz, bu nedenle PI boyası apoptotik hücreleri ve canlı hücreleri etiketleyemez, ancak PI boyası nekrotik hücrelerin hücre zarından hücredeki DNA ile bağlanabilir. Ölü hücrelerdeki PI boyası 488 nm lazerle uyarıldıktan sonra kırmızı floresans yayacak ve ilgili kanal tarafından alınacaktır. Bu nedenle, Annexin V ve PI canlı hücreleri, erken apoptotik hücreleri ve nekrotik hücreleri ayırt etmek için birlikte kullanılabilir.

Şekil 2: Annexin-v/pi çift boyama sonrasında akış sitometrisi sonuçlarının analizi

Ürün siparişi:

2. Erken apoptozis: JC-1 boyama (mitokondriyal membran potansiyelindeki değişikliklerin tespiti)

Apoptoz süreci genellikle mitokondriyal transmembran potansiyelinin yıkımıyla birlikte gerçekleşir ve bu yaygın olarak apoptoz kaskadı sürecindeki en erken olaylardan biri olarak kabul edilir. Nükleer apoptozun özelliklerinin (kromatin konsantrasyonu, DNA kırılması) ortaya çıkmasından önce gerçekleşir. Mitokondriyal transmembran potansiyeli çöktükten sonra hücre apoptozu geri döndürülemez hale gelir. Mitokondriyal transmembran potansiyelinin varlığı rodamin 123, JC-1, JC-10 gibi bazı lipofilik katyonik floresan boyaların mitokondriyal matrikse bağlanmasını sağlar. Floresanslarının artması veya azalması mitokondriyal iç zarın elektronegatifliğinin arttığını veya azaldığını gösterir.

JC-1, mitokondriyal membran potansiyeli △ΨM'yi tespit etmek için yaygın olarak kullanılır ve mitokondride potansiyele bağlı birikim gösterir. Normal mitokondrilerde JC-1, güçlü kırmızı floresans (ex=585 nm, em=590 nm) yayan bir polimer oluşturmak üzere mitokondriyal matriste toplanır; Apoptotik hücrelerde mitokondriyal transmembran potansiyeli depolarize oldu, JC-1 mitokondriden salındı, konsantrasyonu azaldı ve yeşil floresans yayan monomer formuna döndü. Bu nedenle renk değişimi doğrudan mitokondriyal membran potansiyelindeki değişimi yansıtmaktadır. Mitokondriyal depolarizasyon derecesi ayrıca kırmızı/yeşil floresan yoğunluğu oranıyla da ölçülebilir. JC-1 tespiti yaygın bir yöntemdir.

3. Geç apoptozis: TUNEL yöntemi (DNA fragmanı in situ etiketleme yöntemi)

Apoptozisin geç evresinde, kromozomal DNA'nın çift zincir kırıkları veya tek zincir kırıkları nedeniyle çok sayıda yapışkan 3-OH terminali üretilir. Deoksiribonükleotid terminal transferazın (TdT) etkisi altında, lüsiferaz etiketli dUTP, DNA'nın 3-terminaline bağlanabilir, böylece apoptotik hücreler tespit edilebilir, bu tür yöntemlere terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP çentik ucu etiketleme (TUNEL) denir. Normal veya çoğalan hücrelerde neredeyse hiç DNA kırığı olmadığından, 3-OH oluşumu olmaz ve çok azı boyanabilir. TUNEL aslında moleküler biyoloji ve morfolojiyi birleştiren bir araştırma yöntemidir. Tam tek bir apoptotik çekirdeğin veya apoptotik gövdenin yerinde boyanması, apoptozisin tipik biyokimyasal ve morfolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtabilir. Parafine gömülmüş doku kesitlerinin, dondurulmuş doku kesitlerinin, kültür hücrelerinin ve dokulardan izole edilen hücrelerin hücre morfolojisini belirlemek için kullanılabilir ve çok az sayıda apoptotik hücreyi tespit edebilir. Bu nedenle apoptozisin incelenmesinde yaygın olarak kullanılır.

İlgili ürünler: