Puromisin Streptomyces alboniger tarafından üretilen bir aminoglikozid antibiyotiktir. Aminoasil-tRNA molekülünün 3' ucunun bir analoğudur ve ribozomun A bölgesine bağlanarak, genişleyen peptit zincirine dahil olabilir, ribozomdaki peptit translokasyonunu bozabilir, translasyon sırasında erken zincir sonlanmasına neden olabilir ve böylece protein sentezini inhibe edebilir.
Şekil 1 Puromisinin yapısal formülü (CAS NO. 53-79-2)
Puromisin N-asetiltransferazı (pac) kodlayan pac geni, puromisin üreten bakteri Streptomyces alboniger'de puromisine direnç kazandıran bir gen olarak bulunmuştur. Bu özellik artık yaygın olarak pac genine sahip plazmidleri taşıyan memeli stabil transfekte hücre hatlarını taramak için kullanılmaktadır. Puromisinin stabil hücre hatlarının taranmasında yaygın kullanımı, çoğu ticari lentiviral vektörlerde pac genini taşıyan lentiviral vektörlerin özellikleriyle ilişkilidir. Bazı özel durumlarda puromisin, pac genini taşıyan plazmidlerle dönüştürülmüş E. coli suşlarını taramak için de kullanılabilir. Puromisin hızlı etki eder ve düşük konsantrasyonlarda hücre ölümüne neden olabilir. Yapışkan memeli hücreleri 2-5 µg/mL konsantrasyonlarına duyarlıdır puromisinin, süspansiyon hücreleri ise puromisinin 0,5-2 µg/mL kadar düşük konsantrasyonlarına karşı zaten hassastır. Puromisine karşı stabil dirence sahip memeli hücreleri bir hafta içinde üretilebilir.
Stabil Hücre Hattı Taraması
Deneysel Prensip
Pac genini taşıyan bir vektöre ekzojen DNA/shRNA klonlanarak, rekombinant vektör konak hücrelere transfekte edilir ve kromozomlarına entegre edilir, hücre bölünmesiyle stabil bir şekilde iletilir ve son olarak puromisin ile taranır.
Hazırlık ve Ön Deney
1 Önerilen Kullanım Konsantrasyonları
Memeli hücreleri: 1-10 μg/mL, optimum konsantrasyonun ön deneyle belirlenmesi gerekir.
E.coli: Pac genini taşıyan kararlı transforme E. coli'yi LB agar besiyerinde taramak için 125 μg/mL konsantrasyon kullanın. E. coli'nin kararlı transformantlarının puromisin taraması için hassas pH ayarlaması gereklidir.
2 Çözünme Yöntemi
Puromisin'i damıtılmış suda eriterek 50 mg/mL'lik stok solüsyonu hazırlayın, 0,22 μm'lik filtre ile sterilize edin, alikotlayın ve -20°C'de saklayın.
3 Puromisin Öldürme Eğrisinin Belirlenmesi (örnek olarak shRNA transfeksiyonu veya lentiviral transdüksiyon kullanılarak)
Puromisinin etkili tarama konsantrasyonu hücre tipi, büyüme durumu, hücre yoğunluğu, hücre metabolizması ve hücre döngüsü pozisyonu ile ilişkilidir. Transfekte edilmemiş hücreleri öldüren minimum puromisin konsantrasyonunu belirlemek çok önemlidir. Bir öldürme eğrisi oluşturmak için ilk deney için bir Puromisin gradyan tarama ön deneyi gerçekleştirmek esastır.
- 5~8×10 yoğunlukta plaka hücreleri4hücreler/kuyu 24-kuyulu bir plakaya yerleştirilir ve bir gece boyunca kültürlenir.
- Tarama ortamını hazırlayın: Farklı puromisinin konsantrasyonlarını içeren taze ortam (örneğin, 0-15 μg/mL, en az 5 gradyan).
- Taze hazırlanmış tarama ortamıyla değiştirin, kültürlemeye devam edin ve hücre büyümesini gözlemleyin, taze tarama ortamını 2-3 günde bir değiştirin.
- Hücre sağkalımını günlük olarak gözlemleyin; 4-6 gün içinde tüm transfekte edilmemiş hücreleri etkili bir şekilde öldüren ilaç konsantrasyonu minimum konsantrasyondur.
Kararlı Transfektanların Taranması
- 48-72 saat boyunca lentiviral enfeksiyondan sonra (%70-80 birleşme), hücreleri en az 48 saat boyunca uygun konsantrasyonda Puromisin içeren ortamda kültürleyin. Puromisin ile transfekte edilmemiş kontrol grubundaki tüm hücreler öldüğünde, virüsle enfekte gruptaki kalan hücreler pozitif hücrelerdir.
【Not】: ① Antibiyotiklerin etkisi, hücreler aktif bölünme fazındayken en belirgindir. Hücreler çok yoğunsa antibiyotiklerin etkinliği önemli ölçüde azalacaktır. Hücre yoğunluğu %25'i geçmemelidir. ② Hücre büyüme durumunu günlük olarak gözlemleyin; puromisin taraması en az 48 saat gerektirir ve puromisin taramasının etkili konsantrasyonu genellikle 3 ila 10 gün sürer. Virüsün MOI'si ne kadar yüksekse, her hücre o kadar fazla shRNA ve puromisin direnç geni kopyası içerir. Puromisin taraması yaparken, MOI ne kadar yüksekse, hücreler o kadar fazla pac kopyası içerir ve tolere edebilecekleri puromisin konsantrasyonu o kadar yüksek olur. Transfekte hücreleri taramak için puromisin konsantrasyonunu ayarlayın, ancak puromisin konsantrasyonu öldürme eğrisinin minimum etkili konsantrasyonundan düşük olmamalıdır;
- Hücreleri genişletmek için minimum konsantrasyonda Puromisin içeren kültür ortamı eklenir ve qPCR test sonuçları onaylandıktan sonra kriyoprezervasyona geçilir.
| ÜrünS isim | Kedi# | Şartname | Dış görünüş |
| Puromisin Dihidroklorür CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Beyaz ila beyaza benzer toz |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 G | ||
| Puromisin (Çözelti 10 mg/mL) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 mL | Çözüm (H'de 10 mg/mL)2O) |
| 60209ES50 | 5×1 mL | ||
| 60209ES60 | 10×1 mL | ||
| 60209ES76 | 50×1ml |
Ürün Önerisi
Bu Ürünü Kullanan Müşterilerin Yayınları (Kısmi İstatistikler: Bazıları)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, ve diğerleri. Kanonik olmayan bir cGAS-STING-PERK yolu, yaşlanma ve organ fibrozu için kritik olan translasyonel programı kolaylaştırır. Nat Hücre Biyolojisi . 2022;24(5):766- 782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (EĞER:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, ve diğerleri. HNSCC'den türetilen küçük ekstraselüler veziküllerdeki CD73, mikroçevredeki makrofajlar tarafından aracılık edilen tümörle ilişkili immünosupresyonu tanımlar. J Ekstrahücreli Veziküller . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (EĞER:25.841)
[3] Meng F, Yu Z, Zhang D, ve diğerleri.Mutant NF2'nin indüklenen faz ayrımı, antitümör bağışıklığını ortadan kaldırmak için cGAS-STING mekanizmasını hapseder. Mol Hücresi . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (EĞER:17.970)
[ 4] Chen S, Liu S, Wang J, ve diğerleri. TBK1 Aracılı DRP1 Hedeflemesi, Mitokondriyal Dinamikleri ve Fizyolojiyi Yeniden Programlamak İçin Nükleik Asit Algılama Sağlar. Mol Hücresi . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (EĞER:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C ve diğerleri. PTPS, Bölümlere Ayrılmış LTBP1 S-Nitrozilasyonunu Kolaylaştırır ve Hipoksi Altında Tümör Büyümesini Teşvik Eder. Mol Hücresi . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (EĞER:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, ve diğerleri. FACT Kompleksinin İnhibisyonu Anormal Kirpi Sinyalizasyonunu Hedefler ve Düzleştirilmiş Antagonistlere Karşı Direnci Aşar. Kanser Res . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (EĞER:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, ve diğerleri. Genetik olarak kodlanmış floresan sensörler kullanılarak canlı hücrelerde ve canlı organizmada redoks manzaralarının ve dinamiklerinin analizi. Nat Protokolü . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (EĞER:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X ve diğerleri. Akciğer kanseri hücrelerinin proteomik analizi, BCAT1'in kanser hücresi metastazında kritik bir rol oynadığını ortaya koymaktadır. Teranostikler. 2021;11(19):9705-9720. 27 Eylül 2021'de yayınlandı. doi:10.7150/thno.61731 (EĞER:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y ve diğerleri. Uterus globulin ilişkili protein 1 (UGRP1), Streptococcus pneumoniae enfeksiyonu sırasında yeni bir inflamasyon yolunu desteklemek için podoplanin'e (PDPN) bağlanır. Klinik Çeviri Tıbbı 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (EĞER:11.492 )
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, ve diğerleri. MTOR sinyal yolu, otofajiyi inhibe ederek makrofajın fare miyeloid progenitörlerinden farklılaşmasını düzenler. Otofaji . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (EĞER:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, ve diğerleri. SNX10 (nexin 10'u ayırma), SRC'nin otofajik bozunmasını kontrol ederek kolorektal kanser başlangıcını ve ilerlemesini engeller. Otofaji . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (EĞER:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X ve diğerleri. MK2, fare embriyonik kök hücresinin kendi kendini yenilemesini düzenlemek için β-TrCP ubikitin ligazı yoluyla Tfcp2l1 bozunmasını teşvik eder. Hücre Temsilcisi . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (EĞER:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, ve diğerleri. 53BP1'deki AMPK aracılı Fosforilasyon c-NHEJ'yi destekler. Hücre Temsilcisi . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (EĞER:9.423)
[14] Sun Q, Ye Y, Gui A, ve diğerleri. MORTALİN-Ca 2+ Eksen, diffüz büyük B hücreli lenfomada doğuştan rituksimab direncini yönlendirir. Kanser Mektupları . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (EĞER:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, ve diğerleri. S100A16 ve GRP78'in etkileşimi, böbrek tübülointerstisyel fibrozunda IRE1α/XBP1 yoluyla endoplazmik retikulum stresini aktive eder. Hücre Ölümü Bozukluğu . 2021;12(10):942. 13 Ekim 2021'de yayımlandı. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (EĞER:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y, ve diğerleri.DYRK1A'nın K63 bağlantılı ubikitinasyonu, TRAF2 Sprouty 2 aracılı EGFR bozunumuyla hafifletilir. Hücre Ölümü Bozukluğu . 2021;12(6):608. 11 Haziran 2021'de yayınlandı. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (EĞER:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. OLR1'in baskılanması, c-MYC aracılığıyla SULT2B1'i aşağı düzenleyerek glikolitik metabolizmayı zayıflatarak kolon kanseri hücre çoğalmasını ve kemoterapiye direnci baskılar. Hücre Ölümü Bozukluğu 2021;13(1):4. 2021 Aralık 17'de yayınlandı. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (EĞER:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, ve diğerleri. Protein fosfataz PPM1A, memeli bağırsak ve karaciğer rejenerasyonunu yönetmek için YAP'ı defosforile eder ve aktive eder. PLoS Biyoloji . 2021; 19(2):e3001122. 25 Şubat 2021'de yayımlandı. doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (EĞER:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C, hücreler içindeki NRF2 dağıtımını düzenleyerek herpes simpleks virüsü 1 replikasyonunu inhibe eder. Bitkisel ilaç. 2024 Şub;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (EĞER:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Metastaz skoruna göre melanomun metastatik potansiyelinin ve optimal postoperatif adjuvan tedavisinin kodunun çözülmesi. Hücre Ölümü Keşfi. 25 Ekim 2023;9(1):397. doi: 10.1038/s41420-023-01678-6. (EĞER:7.0)
İlgili Ürünler
| Ürün adı | Kedi# | Şartname |
| Siprofloksasin hidroklorür | 60201ES05/25/60 | 5/25/100 gr |
| Ampisilin, Sodyum Tuzu | 60203ES10/60 | 10/100 gr |
| Doksisiklin hidroklorür | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gr |
| Kloramfenikol, USP Sınıfı | 60205ES08/25/60 | 5/25/100 gr |
| Kanamisin Sülfat | 60206ES10/60 | 10/100 gr |
| Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorür (USP) | 60212ES25/60 | 25/100 gr |
| Vankomisin Hidroklorür | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamisin Sülfat Tuzu | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gr |
| Spektinomisin Hidroklorür | 60215ES08 | 5 gr |
| Fleomisin (çözeltide 20 mg/mL) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blastisidin S (Blastisidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nistatin | 60219ES08 | 5 gr |
| G418 Sülfat (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 gr |
| Puromisin (Çözelti 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL |
| Puromisin Dihidroklorür | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 gr |
| Higromisin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 gr (20 mL)/10×1 gr (20 mL) |
| Higromisin B | 60225ES03/10 | 1/10g |
| Eritromisin | 60228ES08/25 | 5/25 gr |
| Zamanlama | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2 gr |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polimiksin B Sülfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |