Deoksiribonükleaz I (DNase I) bir endonükleazdır, uygulaması yalnızca RNA bütünlüğünü korumak için değil, aynı zamanda DNA ayak izi analizi, rastgele DNA kütüphaneleri oluşturma, hücre lizatlarında veya protein özütlerinde yapışkanlığı azaltma vb. içindir. Kısacası, DNase I, DNA'nın enzimle kesilmesini gerektiren hemen hemen her uygulamada kullanılabilir. Aşağıda DNase I ve onun özel uygulamasına dair ayrıntılı bir giriş bulunmaktadır.

1. DNase I nedir?
2. DNA içermeyen RNA ekstraksiyonunun hazırlanması için DNase I
3. Şablon DNA'yı çıkarmak için in vitro transkripsiyon için DNase I
4. rRNA'nın uzaklaştırılması için DNase I
5. DNA etiketlemesi için DNase I
6. Diğer uygulamalar
7. DNase I ürün seçim kılavuzu

1. DNase I nedir?

Deoksiribonükleaz I (DNaz I) farklı dokularda ve vücut sıvılarında bulunan tek veya çift sarmallı DNA'yı sindirebilen spesifik olmayan bir endonükleazdır. 5'-fosfat grubu ve 3'-OH grubu içeren mono- ve oligodeoksinükleotidler üretmek için fosfodiester bağlarını hidrolize edebilir. DNase I'in optimum çalışma pH aralığı 7-8'dir, aktivitesi Ca2+'ye bağlıdır ve Mn2+, Mg2+, Zn2+, vb. gibi iki değerlikli metal iyonları tarafından aktive edilebilir. Mg2+ varlığında, DNase I çift sarmallı DNA'nın herhangi bir yerini rastgele keser; Mn2+ varlığında, DNase I aynı yerde çift sarmallı DNA'yı keserek kör bir uç veya 1-2 nükleotid yapışkan uç çıkıntıları oluşturabilir.

Şekil 1. Mg2+ ve Mn2+ varlığında DNase I tarafından dsDNA'nın kesilmesinin şematik diyagramı.

DNase I kesimleri genellikle spesifik olmayan kesimler olarak kabul edilse de, DNase I'in minör oluk bölgesi gibi belirli dizi parçaları üzerinde etki etme olasılığı daha yüksektir ve purin-pirimidin dizilerinin kesimlerine daha yatkındır. Ancak, DNase I heterojen dsDNA üzerinde etki ettiğinde, dört baz da kesilecek ve spesifik bir baz üzerindeki etki diğer bazlarınkinden 3 kat daha fazla olmayacaktır.

2. DNA içermeyen RNA ekstraksiyonunun hazırlanması için DNase I

Biyolojik deneylerde, ilk adım RNA'nın çeşitli işlevlerini incelemek için nükleik asit hazırlamaktır. Ancak, DNA ve RNA hücre lizis süreci sırasında sıklıkla birlikte serbest bırakıldığından, hangi ekstraksiyon solüsyonu kullanılırsa kullanılsın, ikisindeki müdahaleden kaçınılamaz, bu nedenle müdahaleyi gidermek için belirli enzimlerin kullanılması gerekir. Yüksek kaliteli RNA ekstraksiyonu için, DNase I numuneden kalan DNA'yı çıkarmak için kullanılır.

DNase I, çift sarmallı ve tek sarmallı DNA'yı oligonükleotidlere ve tek nükleotidlere parçalayabilir ve RNA hazırlama ürünündeki DNA etkili bir şekilde parçalanabilir. Daha sonra DNase I, bir durdurma tamponuyla ısıtılarak inaktive edilir. Isıtma işlemi sırasında, RNA molekülünün saç tokası yapısı açılabilir ve bu da RNA'nın ters transkripsiyon sürecine doğrudan girişini kolaylaştırır.
RNA kalitesi deneysel verileri büyük ölçüde doğrudan etkileyecektir. Genel olarak, gDNA kalıntıları RNA ekstraksiyonu sırasında tamamen önlenemez, bu nedenle, zorlu alt akış uygulamalarından (örneğin mRNA ekspresyon analizi, transkriptom analizi, vb.) önce kalıntı gDNA'yı sindirmek için RNA örneklerinin DNase I ile işlenmesi önerilir. gDNA'yı sindirme adımı RNA ekstraksiyonu sırasında, RNA ekstraksiyonundan sonra veya RNA ters transkripsiyonundan önce gerçekleştirilebilir.Ürün konumlandırmasına göre Yeasen tarafından sağlanan ürünler şu şekildedir:

Tablo 1: RNA ekstraksiyonu veya ters transkripsiyondan önce DNA çıkarılmasıyla ilgili ürünlerin listesi

3. Şablon DNA'yı çıkarmak için in vitro transkripsiyon için DNase I

In vitro transkripsiyon (IVT) esas olarak DNA'yı şablon olarak kullanır, ayrıca in vitro transkripsiyon yoluyla RNA elde etmek için karşılık gelen substratlar ve tamponlar kullanır. In vitro transkripsiyon deneylerinde, T7, T3 ve SP6 gibi RNA polimerazları genellikle RNA sentezi için kullanılır. Sentezlenen RNA'da DNA kalıntıları olabilir. DNA kalıntılarının ortadan kaldırılması, alt akış deneylerinin geliştirilmesi için faydalıdır. Örneğin, mRNA aşısı geliştirme aşamasında, kalıntıların uzaklaştırılması kritik bir adımdır, bu da alt akış saflaştırmasının zorluğunu azaltabilir ve ürünün saflığını artırabilir. DNA şablonu genellikle Rekombinant DNase I (RNase içermeyen) kullanılarak uzaklaştırılır.mRNA sentez sürecine göre Yeasen’in sağladığı ürünler şu şekildedir: