Bilim insanları yeni bir geni bağlamak için hangi enzimleri kullanır? Söylemeye gerek yok, DNA ligazı dahildir. Peki rekombinant DNA'da DNA ligazı neden bu kadar önemlidir? Çünkü DNA ligazı, hedef parçayı vektöre bağlamaktan sorumludur ve bu, deneyin başarısını belirleyen temel unsurlardan biridir. Bir tür DNA ligazı olarak, T4 DNA ligazı moleküler klonlama deneylerinde hangi rolü oynar? Nasıl çalışır? T4 DNA ligazı daha sonra ayrıntılı olarak tanıtılacaktır.

1. T4 DNA Ligaz Nedir?
2. T4 DNA ligazının işlevi nedir?
3. Yeasen Biotech T4 DNA ligazı NGS adaptör ligasyonu için kullanılabilir
4. Yeasen Biotech T4 DNA ligazı için bir seçim kılavuzu

1. T4 DNA Ligaz Nedir?

T4 DNA ligazı, DNA molekülleri arasındaki ligasyon reaksiyonunu katalize eden ATP bağımlı bir ligazdır. Esas olarak 3'-hidroksil ve 5'-fosfat uçlarını bağlayarak fosfodiester oluşturur. DNA ligazları, tüm organizmalarda DNA replikasyonu ve onarım süreçlerinde yer alır. Faj kodlu T4 DNA ligazı, E. coli'nin faj T4 enfeksiyonu sırasında üretilir.
Genetik mühendisliğinde kullanılan ligazlar esas olarak E. coli DNA ligazı ve T4 DNA ligazıdır, ikincisi şu anda daha yaygın olarak kullanılmaktadır. T4 DNA ligazı, iki bitişik nükleotidi bağlamak için çift sarmallı DNA, çift sarmallı RNA veya DNA/RNA hibrit zincirlerindeki tek sarmallı çentikleri onarabilir ve DNA onarımı ve rekombinasyonunda önemli bir rol oynar.
Rekombinant plazmit inşa sürecinde, T4 DNA ligazı, rekombinant plazmit inşa deneyini tamamlamak için restriksiyon enzimleriyle birlikte kullanılabilir. Çift sarmallı DNA'nın 5'-P ucu ile 3'-OH ucu arasında bir fosfodiester bağının oluşumunu katalize edebilir ve yapışkan uç bağlantısı ve kör uç bağlantısı için iyi bir bağlantı verimliliğine sahiptir.

Şekil 1. T4 DNA ligaz mekanizması

2. T4 DNA ligazının işlevi nedir?

2.1 Vektör İnşası

Vektör inşa deneylerinde, farklı restriksiyon enzimleri farklı tipte uçlar üretebilir. Farklı uçlar için, T4 DNA ligazı farklı ligasyon stratejilerine sahip olacaktır.

2.1.1 Restriksiyon enzimleriyle klonlama, tek sindirimle üretilen yapışkan uçlar

Vektörün inşası sırasında, hedef genin DNA parçasını kesmek için aynı restriksiyon endonükleazı kullanılırsa ve vektör molekülü aynı yapışkan ucu üretebilirse, T4 DNA ligazı doğrudan rekombinasyon bağlantısını gerçekleştirebilir. Ancak, yapışkan uçlar aynı olduğundan, hedef gen vektöre ileri veya geri yönde yerleştirilebilir, bu da doğru rekombinant klonları tarama iş yükünü kolayca artıracaktır. Vektör inşası için çift enzim sindirimi yöntemini kullanmayı düşünün.
Ek olarak, tek enzim sindirimi ile hazırlanan vektörün kohezif uçları da eşleştirilebilir ve daha sonra T4 DNA ligazının etkisi altında nükleotidler arasında fosfodiester bağları oluşur ve bu da vektörün kendi kendine bağlanmasıyla sonuçlanır. Sindirilen vektörü işlemek için alkalin fosfataz kullanmak, vektörün 5' ucundaki fosfat grubunu kaldırabilir, böylece vektör kendi kendine bağlanmayı tamamlayamaz. Böylece, T4 DNA ligazının etkisi altında vektör ve hedef parça, rekombinant vektörün yapımını tamamlamak için bağlanır.

2.1.2 Restriksiyon enzimleriyle klonlama, çift sindirimle üretilen yapışkan uçlar

Vektör oluşturma sürecinde, hedef parçacığı ve vektörü sindirmek için farklı yapışkan uçlara sahip iki restriksiyon enzimi kullanılırsa, iki farklı yapışkan uç üretilebilir. Bu noktada, T4 DNA ligazı, hedef parçacığın vektöre doğru yönde sokulmasını sağlamak için aynı yapışkan uçları seçici olarak bağlayabilir. Şekil 2'deki hedef parçacığı ve vektör aynı anda EcoR I ve BamH I ile sindirildiğinde, aynı yapışkan uçlar bağlanabilir. Hedef parçacığı ve vektör arasında yalnızca bir bağlama yönü vardır.

Şekil 2. Çift enzim sindirimi ile oluşturulan yapışkan uç ligasyonu^[1]

2.1.3 Restriksiyon parçalarının klonlanması, künt uç

Bazı restriksiyon endonükleazları, Sma I ve diğerleri gibi enzimatik kesmeler sırasında kör uçlar da üretebilir. T4 DNA ligazı, vektör ve ek arasında doğrudan bir fosfodiester bağı oluşturabilir ve bazlar arasında eşleşmeye gerek yoktur. Ancak, bu yöntemin ligasyon verimliliği düşüktür ve vektörün kendi kendine ligasyonuna eğilimlidir. Genellikle, kör uçlar yapışkan uçlara dönüştürülebilir ve daha sonra bağlanabilir. Örneğin, hedef parçanın ve vektörün uçlarına tamamlayıcı poli A ve poli T bazları eklemek ve yapay olarak yapışkan tamamlayıcı uçlar, terminal deoksinükleotidil transferaz tarafından bağlantı verimliliğini artırır.

2.1.4 TA klonlama

TA klonlamada kullanılan T vektörünün 3' ucunda bir T çıkıntısı vardır. Hedef parçanın DNA dizisi belirsiz olduğunda, hedef gen parçası TA klonlama ile T vektörüne bağlanabilir ve hedef gen dizileme ile belirlenebilir. PCR'de kullanılan Taq DNA polimerazı terminal transferaz aktivitesine sahiptir ve DNA parçasının 3' ucuna bir nükleotid "A" ekleyebilir. T4 DNA ligazı, Taq DNA polimerazı tarafından çoğaltılan ürünü doğrudan T vektörüne bağlayabilir ve PCR ile çoğaltılan ürün yapay adaptörler eklemeden verimli klonlama amacına ulaşabilir.

Şekil 3. TA klonlamanın iş akışı^[2]

2.2 NGS adaptör ligasyonu

Yeni nesil dizileme kütüphanesinin inşası sırasında, dizilemeyi tamamlamak için dizileme çipindeki akış hücresine sabitlenebilmesi için yapay adaptörün PCR ürününe bağlanması gerekir. TA klonlama ligasyon bağlayıcı kütüphane inşası çok yaygın bir teknik araçtır ve prensibi yukarıda belirtilen TA klonlamasına benzerdir. Dizilenecek DNA parçası 5' ucunda fosforile edildikten ve 3' ucuna "A" eklendikten sonra, tamamlayıcı olur ve "T" yapışkan ucu olan adaptörle eşleştirilir. Daha sonra tam çift zincir oluşturulur ve makine tarafından dizilenir.
TA ligasyonu sırasında farklı örnek tipleri veya nükleik asit fragman yapısının karmaşıklığı ligasyonun verimliliğini etkileyeceğinden, farklı platformlardaki adaptörlerin de nihai kütüphane sonucu üzerinde etkisi olacaktır.
Örneğin, MGI platformunun Bubble adaptörü özel bir sekonder yapıya sahip olup T4 DNA ligazı için çok yüksek ligasyon verimliliği gerektirmekte ve ligasyon verimliliğinin azalması kütüphanenin çıktısını doğrudan etkilemektedir.

Şekil 4. Genel adaptör bağlama işlemi

3.Yeasen Biotech T4 DNA ligazı NGS adaptör ligasyonu için kullanılabilir

Yeasen Biotech özel olarak geliştirdi Hızlı T4 DNA ligazı NGS kütüphanesi inşa sürecinde DNA parçalarının ve adaptörlerinin bağlanması için. Enzim, sadece hızlı bağlantı hızı değil, aynı zamanda çeşitli numune tipleriyle uyumlu olması nedeniyle verimli bir bağlanma yeteneğine sahiptir, bu da karmaşık yapılara sahip nükleik asit parçalarının bağlanması için daha avantajlıdır. Şu anda, çok sayıda müşterinin yüksek verimli dizilemesiyle doğrulanmıştır. MGI platformunda Bubble adaptörlerinin bağlanması için mükemmel dizileme kalitesi de elde edilebilir.

3.1 Ultra yüksek ligasyon verimliliğine sahip Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligazı

Farklı adaptör tiplerine sahip kütüphaneler oluşturmak için Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligazını kullanın. Örnek 170 bp'lik bir cfDNA taklididir ve sonuçları tespit etmek için Agilent 2100 kütüphanesi kullanılır. ①Bağlantısız adaptör ürünü; ②Tek uçlu adaptör ürünü; ③Çift uçlu adaptör ürünü; ④Artık adaptör. Sonuçlardan, tek uçlu ve çift uçlu adaptörlerin ligasyon verimliliğinin çok yüksek olduğu görülebilir.

Şekil 5. Agilent 2100 tarafından tespit edilen farklı tipteki ligasyon ürünleri

3.2 Mükemmel kütüphane verimine sahip Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligazı

Farklı tipteki kütüphanelerin inşasında Fast T4 DNA ligazı kullanıldığında, diğer T4 DNA ligazlarına kıyasla kütüphane verimleri daha iyidir.

Tablo 1. Kütüphanelerin farklı türdeki örneklerinin verimi

4. Yeasen Biotech T4 DNA ligazı için bir seçim kılavuzu

Yeasen, üç büyük biyolojik reaktifin araştırma, geliştirme, üretim ve satışıyla uğraşan bir biyoteknoloji şirketidir: moleküller, proteinler ve hücreler. Fast T4 DNA ligase'e ek olarak, Yeasen Biotech ayrıca Yeni T4 DNA ligazı Ve Hızlı T4 DNA ligazı arasından seçim yapabilirsiniz. Bunları aşağıdaki tabloda gösterilen uygulamalara göre seçebilirsiniz:

Tablo 2: İlgili ürünler

Referanslar

[1] W. Yuan. Gen Mühendisliği[M]. Kimya Endüstrisi Basını, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. Sentetik Biyoloji için Genlerin Klonlanması - ScienceDirect[J]. Moleküler Biyoloji (Üçüncü Baskı), 2019:199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, ve diğerleri. DNA Ligazları: Yapı, Reaksiyon Mekanizması ve İşlevi[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA Ligazları: İlerleme ve Beklentiler[J]. Biyolojik Kimya Dergisi, 2009, 284(26):17365-17369.