- Arka plan
Bu raporda özetlenen veriler MycAway için Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. tarafından gerçekleştirilmiştir.T.M. Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit Kiti (2G) ürün.
Özet veriler yalnızca kullanıcının referansı içindir ve kullanıcının, yöntemin kullanıcının gereksinimlerini karşılayabildiğini doğrulamak için kendi örneklerini kullanarak mikoplazma yöntemini doğrulaması gerekir. Bu kiti kullanan tüm laboratuvarların aşağıdaki parametreleri doğrulamaları önerilir: Tespit sınırı, Özgüllük ve Dayanıklılık.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. bu kit için detaylı yeterlilik raporunu sağlayabilir. Kullanıcı bu raporu kullanırsa, yalnızca uygunluk (Tespit limiti ve Spesifite dahil) doğrulanmalıdır.
Doğrulama İçeriği：
| Performans | Doğrulama Parametreleri | Doğrulama Sonuçları |
| Algılama Sınırı | Mikoplazma Suşu Tespit Limiti | 10 tip farmakope mikoplazması için tespit limiti: 10 CFU/mL, her biri 24 kez test edildi ve tespit oranı ≥%95 idi. |
| Özgüllük | Örnek Matris Girişimi | 9 farklı numune matrisi ve DNA seyreltme solüsyonu test edildi, mikoplazma tespit edilmedi. |
| Çapraz reaksiyon | Biyofarmasötiklerde 14 suş ve 6 yaygın kullanılan mühendislik hücresi test edildi, mikoplazma tespit edilmedi. | |
| Dayanıklılık | Donma-Çözülme Kararlılığı | Kitin performansını etkilemeden 20 kez tekrarlanan donma-çözülme döngüsüne dayanabilir. |
| Termal İvmelenme Kararlılığı | 37°C’de 14 gün, 4°C’de 30 gün boyunca etkilenmez. | |
| Enstrüman Uyumluluğu | ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 ve Roche LightCycler®480 ile uyumludur. | |
| Kapsam | Mycoplasma DNA Tiplerinin Kapsamı | Mycoplasma 16S rRNA dizilerini kullanarak yapılan veritabanı karşılaştırması Mollicutes sınıfındaki 183 türü kapsamaktadır. |
- Deneysel materyaller ve yöntemler
2.1 Benim UzaktaT.M. Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit Kiti (2G), Satıcı: Yeasen, Katalog No.: 40619ES60.
2.2 MolSafT.M. Manyetik Kalıntı DNA Örnek Hazırlama Kiti, Satıcı: Yeasen, Katalog No.: 18461ES60.
2.3 Mycoplasma duyarlılık standartları, suşları National Collection of Type Cultures (NCTC)'den olan Minerva Biolabs'dan (MB) satın alınmıştır. Duyarlılık standartları inaktif mikoplazmadır ve mikoplazma tespiti için nükleik asit amplifikasyon yönteminin (qPCR/PCR yöntemi) metodolojik doğrulaması için kullanılır. EP 2.6.7 ve JP G3 gerekliliklerini içeren toplam 10 çeşit mikoplazma satın alınmıştır. Standartların bilgileri aşağıdaki gibidir:
| Satıcı | Katalog No. | NCTC Hayır. | ATCC HAYIR. | Malzeme Adı |
| Minerva Biyolaboratuvarları (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma argininisi |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Ağız yoluyla mikoplazma | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma pnömonisi | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma sinovya | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Acholeplasma laidlawii (Aşöloplazma laidlawii) | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ Duyarlılık Standardı Spiroplasma sitri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10CFU™ Hassasiyet Standardı Mikoplazma tükürük |
2.4 Orijinal veriler: Elektronik versiyon 'Deneysel Rapor'da kaydedildi 'MycAway' ana dosyasının alt dosyasıT.M. Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit Kiti (2G)'.
2.5 Yöntemler: Deneyde kullanılan malzemeler ve çalışma yöntemleri temel olarak Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. tarafından üretilmiş veya belirlenmiş olup, uzun süredir değerlendirilmekte ve doğrulanmakta olup, kit geliştirme ve üretimi ISO 13485 sistemini takip etmektedir.
- Nitelik içerikleri ve sonuçları
3.1 Algılama Sınırı (LOD)
Nükleik asit ekstraksiyonu ve 10 CFU/mL Mycoplasma standart suşunun tespiti, standart suş için talimatlara ve ayrıca ekstraksiyon ve tespit kiti için talimatlara göre gerçekleştirildi. 10 CFU/mL Mycoplasma standart suşu için toplam 24 analiz elde edildi. Her deneyde NCS (Negatif Kontrol Örneği) ve NTC (Şablonsuz Kontrol) örnekleri aynı anda test edildi.
Sonuçlar, NCS ve NTC sonuçlarının tatmin edici olduğunu ve 24 adet 10 CFU/mL numunenin tamamının pozitif çıktığını, 24 testten en az 23'ünün pozitif sonuç olması gerekliliğinin karşılandığını gösterdi.
| HAYIR. | Malzeme Adı | Bakteriyel sıvının konsantrasyonu |
| 1 | Mikoplazma argininisi | 10 KOB/mL |
| 2 | Ağız yoluyla mikoplazma | 10 KOB/mL |
| 3 | Mikoplazma gallisepticum | 10 KOB/mL |
| 4 | Mikoplazma pnömonisi | 10 KOB/mL |
| 5 | Mikoplazma sinovya | 10 KOB/mL |
| 6 | Mikoplazma fermentans | 10 KOB/mL |
| 7 | Mikoplazma hyorhinis | 10 KOB/mL |
| 8 | Acholeplasma (Aköle plazması) laylaii | 10 KOB/mL |
| 9 | Spiroplasma sitri | 10 KOB/mL |
| 10 | Mikoplazma tükürük | 10 KOB/mL |
Tablo 1 Doğrulanmış suşlara ilişkin bilgiler
| 10 KOB/mL | Deney 1 | Deney 2 | Deney 3 |
| Tespit Oranı | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Toplam | 24/24 | ||
Tablo 2 Tespit sınırı sonuçları
3.2 Spesifiklik
3.2.1 Mikoplazma test aralığı
Kitteki primer prob dizileri, veritabanındaki 16S rRNA genomuyla karşılaştırıldı. Biyoenformatik analiz yoluyla, MycAway'inT.M. NextSense Biologicals'ın Mycoplasma qPCR Tespit Kiti (Prob Yöntemi), 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma ve 7 Cholestrongyla vb. olmak üzere en az 183 Zooxanthellae türünü kapsayabilir.
3.2.2 Örnek matris girişimi
9 substrat (Dulbecco'nun MEM'i, Ham'ın F-10 Ortamı, M-199 Ortamı, Ham'ın F-12K Kaighn'i, RPMI-1640 Ortamı, McCoy'un 5A'sı, Ham'ın F-12K Kaighn'i +1.0mM/L Glutamin, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.05 mM L-Glutamin, DMEM-düşük glikoz Standart Ortamı) numuneler örnek matrisindeki girişimi doğrulamak için kullanıldığında, sonuçlar ortamın kit reaktiflerine herhangi bir girişimde bulunmadığını gösterdi.
3.2.3 Flexibacteria tespit aralığı
10 CFU/mL'de inaktif mikoplazmaların (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) ekstraksiyonu ve tespiti, NCS ve NTC örnek testlerinin yanı sıra gereklidir.
Sonuçlar NCS ve NTC'nin tespit edilemediğini ve sonuçların negatif olduğunu, 10 mikoplazma türünün tamamının tespit edildiğini ve sonuçların pozitif olduğunu gösterdi.
3.2.4 Çapraz reaksiyon
Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae) dahil olmak üzere 14 esnek olmayan bakteri türü için, bir dizi diğer yaygın basil-kok-mantar mikroorganizması (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis ve Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) ve altı tasarlanmış hücre (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) mikoplazma tespiti için kullanıldı. MolSafT.M. Kalan DNA Örneği Ön İşleme Kiti (şişeler) ve MycAway için Manyetik Boncuk YöntemiT.M. Mycoplasma qPCR Tespit Kiti (Prob Yöntemi) (2G) kullanıldı ve her deney PCS, NCS ve NTC örnek testleri ile eş zamanlı olarak gerçekleştirildi.
Sonuçlar PCS, NCS ve NTC sonuçlarının tatmin edici olduğunu, test örneklerinin negatif olduğunu ve çapraz reaksiyon oluşmadığını gösterdi.
3.3 Sağlamlık
3.3.1 Donma-çözülme kararlılığı
Mycoplasma test kiti -25℃~-15℃ sıcaklık koşullarında dondurma-çözme deneylerine tabi tutuldu ve sonuçlar kitin 20 kez tekrarlanan dondurma-çözme işlemine dayanıklı olduğunu ve performansının etkilenmediğini gösterdi.
3.3.2 Hızlandırılmış Stabilite
Mycoplasma tespit kiti, sırasıyla 14 gün boyunca 37℃'de ve 30 gün boyunca 4℃'de ısıyla hızlandırıldı ve sonuçlar ürün performansının etkilenmediğini gösterdi.
3.3.3 Enstrüman uygulanabilirliği
Mikoplazma tespit kiti için, kitte bulunan pozitif kontrol ve Mycoplasma pneumoniae DNA’sının farklı konsantrasyonları test edilecek örnek olarak kullanıldı ve deneyler sırasıyla Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S ve Roche LightCycler®480 olmak üzere dört farklı marka ve model üzerinde gerçekleştirildi.Deneyler dört farklı marka ve modele ait Shanghai Hongshi SLAN-96S ve Roche LightCycler®480 qPCR cihazlarında gerçekleştirildi.
Sonuçlar, test edilecek örneklerin farklı üretici modellerine ait qPCR cihazlarında tespit edildiğini ve negatif kontrol sonuçlarının yeterli olduğunu, kitin performansının etkilenmediğini gösterdi.
- 4.Referans
4.1 Mikoplazma muayene yöntemi <3301>. Çin Farmakopesi, Bölüm III [S]. Pekin: Çin Bilim ve Teknoloji Basını, 2020: 542-543.
4.2 Analitik yöntemlerin doğrulanmasına ilişkin kılavuzlar <9101>. Çin Farmakopesi, Bölüm III [S]. Pekin: Çin Bilim ve Teknoloji Basını, 2020: 682.
4.3 İlaçların mikrobiyolojik testlerine yönelik alternatif yöntemlerin doğrulanmasına ilişkin kılavuzlar <9201>. Çin Farmakopesi, Bölüm III [S]. Pekin: Çin Bilim ve Teknoloji Basını, 2020: 684.
4.4 Mikoplazmalar. Avrupa Farmakopesi[S]. 10. Baskı, 2020: Bölüm 2.6.7, 194-199.
4.5 Biyoteknolojik/Biyolojik Ürünlerin Üretiminde Kullanılan Hücre Substratları için Mikoplazma Testi <G3-14-170>. Japon Farmakopesi[S]. 18. Baskı, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham ve diğerleri. Kasıtlı mikoplazma kontaminasyon olayları sırasında CHO hücre biyoreaktör kültürlerinde üretilen monoklonal antikorların ürün kalite nitelikleri üzerindeki etkileri. Biyoteknoloji ve Biyomühendislik. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Hücre substratlarının ve biyolojiklerin mikoplazma testi: Alternatif mikrobiyolojik olmayan tekniklerin gözden geçirilmesi. Mol Hücre Probları. 2011 Nisan-Haziran;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Veteriner aşıları ve biyolojik ürünlerin Mikoplazma kontaminasyonunu test etmek için bir PCR tespit yöntemi. Lett Uygulamalı Mikrobiyoloji. 2015 Şubat;60(2):174-180.
Sipariş bilgileri
| Tanım | Parça Numarası |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mikoplazma qPCR Tespit Kiti (2G) | 40619ES |