Biyoteknolojinin hızla gelişmesiyle birlikte, yeni bir tedavi yöntemi olarak mRNA terapisi, güçlü programlanabilirliği ve hızlı yanıt hızı nedeniyle büyük ilgi görmüştür. mRNA aşıları ve gen terapisi alanlarında, yüksek kaliteli mRNA'yı verimli bir şekilde sentezlemek, terapötik hedeflere ulaşmada önemli bir adımdır. Bu süreçte, T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) önemli bir rol oynar, mRNA'nın in vitro sentezini verimli bir şekilde katalize edebilir.
T7 RNAP, mRNA sentezinde önemli bir rol oynamasına rağmen, pratikte yan ürün olarak sıklıkla çift sarmallı RNA (dsRNA) üretir. dsRNA, birçok virüsün ayırt edici özelliklerinden biridir ve bu nedenle hücre içi dsRNA bağlayıcı proteinler tarafından kolayca tanınır ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini ve inflamatuar reaksiyonları tetikler. Bu, mRNA formülasyonları daha yüksek düzeyde dsRNA içeriyorsa, bunun gereksiz bağışıklık aktivasyonuna yol açabileceği ve bunun da terapötik etkinliği etkileyebileceği veya ciddi yan etkilere neden olabileceği anlamına gelir. Aşırı dsRNA, mRNA'nın çeviri etkinliği ve mRNA stabilitesi de dahil olmak üzere normal işlevine müdahale edebilir ve dolaylı olarak mRNA terapisinin etkinliğini etkileyebilir.
Şekil 1: dsRNA yan ürünlerinin etkisi ve optimize edilmiş T7 RNAP reaksiyonunun etkisi.
Bu nedenle, dsRNA üretimini azaltmak için etkili yöntemler geliştirmek ve benimsemek, mRNA teknolojisi geliştirmenin önemli bir parçasıdır. Araştırmacılar, geliştirilmiş T7 RNA polimerazlarının kullanımı, modifikasyon nükleotidleri, IVT transkripsiyon tamponlarının optimizasyonu ve akış aşağı saflaştırma süreçleri dahil olmak üzere çeşitli stratejiler geliştirdiler. Yeasen Biology, mRNA in vitro sentezi için çekirdek enzim ham maddesi olan T7 RNA polimerazını sürekli olarak geliştirmek için ZymeEditor tarafından yönetilen evrim platformunun yeteneklerini kullanır. T7 RNA polimerazın RDRP aktivitesini baskılayan, dsRNA oluşumunu temelden azaltan ve dolayısıyla dsRNA içeriğini önemli ölçüde düşüren düşük dsRNA'lı bir T7 RNA polimeraz geliştirdik.
Ürün Verileri
Verim: 9 mg/mL'nin üzerinde
dsRNA İçeriği: dsRNA içeriği en az 10 kat önemli ölçüde azaltılmıştır
Kapama Verimliliği: %99'un üzerinde
Düşük dsRNA T7 RNA Polimeraz Tarama Süreci:
1) 10'dan fazla rastgele mutasyon kütüphanesi olan bir rastgele kütüphane ve FADS yüksek verimli tarama yönteminin oluşturulması^6 görüntülendi.
2) yarı rasyonel tasarım ve mikro plaka teknolojisi, siteye doymuş bir kütüphaneyi taramak için kullanıldı. Her iki yöntem de düşük dsRNA T7 RNA polimeraz mutantları üretti. Diğer göstergelerin (bütünlük/kapaklama verimliliği/verim vb. gibi) azalmamasını sağlayarak dsRNA içeriğini göz önünde bulundurarak, Birkaç mutant seçildi ve CleaScrip™ T7 adlı mutant ticari uygulama için kullanıldı.
Ürün Verileri
Farklı uzunluk uygulama senaryolarında, düşük dsRNA T7 RNA Polimerazının hem WT T7 hem de rekabetçi ürünlere kıyasla oldukça önemli bir azalma gösterdiği, Verim ve bütünlüğün azalmamasını sağladığı görülmüştür.
| Parça Uzunluğu | T7 RNA poli | Teslim olmak(mg/mL） |
Bütünlük(%） | dsRNA İçeriği (1 ug RNA başına üretilen dsRNA'nın ng'si) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88.3 | 0,4273 |
| TemizSkript™ T7 | 12.1 | 89.9 | 0,0129 | |
| Şirket A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9 bin | T7-WT | 9.5 | 81.9 | 2.9180 |
| TemizSkript™ T7 | 9.0 | 82.0 | 0,0379 | |
| Şirket A | 7.2 | 78.7 | 0,1805 |
Kullanarak 2,5 mM'lik bir kap konsantrasyonunda, WT'ye kıyasla farklı parça uzunluklarında mükemmel kap verimliliği hala elde edilebilir. Ek olarak, hücresel düzeyde üstün protein ekspresyon performansı da gözlemlenir.
| Kapak analog girişi（mM） | Verimliliği Kapatma（%）4K | |
| İŞTE | Düşük dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Patenti Amerika Birleşik Devletleri'nde alınmıştır.
Ürün Bilgileri
| Ürün Adı | Katalog numarası | Şartname | Hacim |
| TemizleT.M. T7 RNA Polimeraz (düşük dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| TemizleT.M. T7 RNA Polimeraz GMP sınıfı (düşük dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |