Şekil 1: In vitro RNA transkripsiyon süreci

Ürün avantajları

Yüksek verim: transkripsiyon reaksiyonu yoluyla 2 saatte 200 μg'a kadar üretebilir

Daha iyi çok yönlülük: 20nt-10000nt RNA transkripsiyonu için uygundur

Mükemmel performans: IVT işlemi sırasında transkripsiyonun yan ürünlerini etkili bir şekilde azaltır

Çoklu uygulamalar: sıradan, etiketli ve modifiye edilmiş RNA sentezi için kullanılabilir

Ürün Özellikleri

Şekil 2: Farklı uzunluklardaki transkriptlerin verimi

Şekil 3: Farklı uzunluklardaki transkriptlerin kalitesi

Şekil 4: İfadesi transkribe edilmiş mRNA içinde HEK-293 hücreler

Not: mRNA, Vaccinia Kapama Enzimi (Yeasen#10614/10615) ile kaplanmıştır.

Deneysel yöntemler

Çözme reaktifleri

T7 RNA Polimeraz Karışımını kısa bir süre santrifüjleyin ve yerleştirin BT buz üzerinde. 10×Transkripsiyon Tamponu ve ribonükleotidi çözünS (ATP, CTP, GTP, UTP) karıştırın ve tüpün dibine kadar santrifüj edin, oda sıcaklığında 10×Transkripsiyon Tamponu koyun ve buza 4 tip ribonükleotid koyun.

B.Oda sıcaklığında montaj transkripsiyon reaksiyonu

Aşağıdaki sisteme göre reaksiyon sistemini hazırlayın:

Bileşenler	Hacim (µL)	Son konsantrasyon
RNaz içermeyen H2O	20'ye kadar	-
10×Transkripsiyon Tamponu	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (her biri 100 mM)	Her biri 2	Her biri 10 mM
Şablon DNA	1 µg	-
T7 RNA Polimeraz Karışımı	2	-

Notlar:

1. Reaksiyon oda sıcaklığında yapılandırılır. 10× Transkripsiyon Tamponu spermidin içerdiğinden, yüksek spermidin konsantrasyonu düşük sıcaklıkta DNA şablonunun çökmesine neden olabilir.
   Kısa transkriptler (<100 nt) için 2 µg şablon kullanılabilir, transkripsiyon süresi 4-8 saate kadar uzatılabilir.
   3. Uzun transkriptler (>1000 nt) için transkripsiyon şablonu olarak doğrusallaştırılmış plazmitlerin kullanılması önerilir.
   4. Buharlaşmayı önlemek için PCR cihazında, sıcak kapak açıkken reaksiyonu gerçekleştirin.
   5. Reaksiyon ürünü beyaz bir çökeltiye sahip olabilir. Çökelti, aşağıdakiler tarafından üretilen magnezyum pirofosfattır: reaksiyon çözeltisindeki serbest pirofosfat ve magnezyum iyonları sonraki deneyleri etkilemez. Bunu çıkarmak istiyorsanız, biraz EDTA ekleyebilirsiniz. EDTA'nın eklenmesi sonraki deneyleri etkiliyorsa, üstteki sıvı santrifüjleme ile de geri kazanılabilir.
   6. Reaktifleri ve kapları RNase kontaminasyonundan uzak tutun.

C. 37°C'de 2 saat inkübe edin

Bileşen solüsyonunu karıştırın, tüpün dibine kadar kısa bir süre santrifüj edin ve 37°C'de 2 saat inkübe edin. Transkript uzunluğu 100 nt'den azsa, reaksiyon süresini 4-8 saate uzatın.

D.DNase I tedavisi (isteğe bağlı)

Reaksiyon tamamlandıktan sonra her tüpe 2 μL DNase I (RNase içermeyen) ekleyin ve şablon DNA’yı çıkarmak için 37°C’de 15 dakika inkübe edin.

Sıkça Sorulan Sorular

1. Düşük transkript verimi

Şablonun kalitesi verimle yakından ilişkilidir. Deney grubunun verimi kontrol grubundan önemli ölçüde düşüktür. Olası nedenler şunlardır:

• Deneysel şablon inhibitör bileşenleri içermektedir;
• Şablonda bir sorun olabilir.

Öneriler: ① Şablonu yeniden saflaştırın; ② Şablonun kantifikasyonunu ve bütünlüğünü belirleyin; ③ Reaksiyon süresini uzatın; ④ Şablon giriş miktarını artırın; ⑤ Diğer promotörleri kullanın ve Diğer RNA polimerazlar.

2. Kısa transkriptlerin düşük verimi

Kısa şablon parçaları reaksiyonu inhibe edebilir. Transkripsiyon ürünü 100 nt'den az olduğunda, verimi artırmak istiyorsanız, reaksiyon süresini 4-8 saate uzatın veya şablon miktarını 2 μg'a çıkarın.

3. RNA transkripsiyon uzunluğu daha büyük Beklenenden daha fazla

Elektroforez sonucu ürün bandının beklenen boyuttan daha büyük olduğunu gösteriyorsa olası nedenler şunlar olabilir: ①Plazmit şablonu tamamen doğrusallaştırılmamış olabilir; ②Duyusal ipliğin 3' ucu belirgin bir yapıya sahiptir; ③RNA tamamen denatüre olmamış ikincil bir yapıya sahiptir.

Öneriler: ①Şablonun tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ek doğrusallaştırma gerçekleştirin; ②3' çıkıntılarını önlemek için uygun bir restriksiyon enzimi seçin veya devam etmeden önce transkripsiyonu tamamlamak için Klenow Fragment/T4 DNA polimerazını kullanın; ③RNA ürünlerini tespit etmek için denatüre jel kullanın.

4. RNA transkripsiyon uzunluğu daha küçük Beklenenden daha fazla

Elektroforez, ürün bandının beklenen boyuttan daha küçük olduğunu gösteriyorsa, olası nedenler şunlardır: şunlardır: ①Şablon, T7 RNA polimeraz sonlandırıcıya benzer bir sonlandırma dizisi içerir; ②GC içeriği şablon çok yüksek.

Öneriler: ①Tepkime sıcaklığını düşürün (örneğin, 30°C). Bazen sıcaklığı düşürmek transkripsiyon uzunluğunun uzamasına katkıda bulunabilir, ancak verimi azaltın. Başka deneyin Transkripsyon için RNA polimerazları; ②Şablon GC içeriği yüksekse, reaksiyonu 42℃'de gerçekleştirin veya verimi ve transkripsiyon uzunluğunu artırmak için SSB ekleyin.

5. Transkripsiyonel ürünlerin elektroforetik takibi

Elektroforez sırasında kuyruklanma şunlardan kaynaklanabilir: ① Deneysel işlem sırasında RNase kontaminasyonu; ②DNA şablonu RNazlarla kirlenmiştir.

Öneriler: ①RNase içermeyen pipet uçları ve EP tüpleri kullanın, tek kullanımlık lateks eldivenler ve maskeler takın ve tüm reaktifler RNase içermeyen H ile hazırlanmalıdır.₂O. ②Şablon DNA’yı tekrar saflaştırın.

Sipariş bilgileri

Ürün adı	Katalog numarası	Sşartname
T7 Yüksek Verimli RNA Sentezi Kiti	10623ES	50/100/500T
T7 RNA Polimeraz GMP sınıfı (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
Pirofosfataz, İnorganik GMP sınıfı (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Fare RNaz inhibitörü GMP sınıfı (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
mRNA Vaccinia Kapanma Enzimi GMP sınıfı	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-Metiltransferaz GMP sınıfı	10612ES	10KU/50KU/250KU
Deoksiribonükleaz I (DNase I) GMP sınıfı	10611ES	500/2000/10000 U
Hieff NGS® mRNA İzolasyon Ana Kiti	12603ES	24/96T