Son yıllarda, mRNA teknolojisinin geliştirilmesi ve uygulanması ilgi çekmeye devam etmektedir. mRNA ilaçları, antijen proteinlerini kodlayan mRNA'yı insan vücuduna aşılamayı içerir. İnsan hücrelerinin içindeki genetik materyali kullanarak antijen proteinlerini ifade eder ve sentezlerler. Bu süreç, antijen proteinleri aracılığıyla vücudun bağışıklık sistemini harekete geçirir ve aktive eder, hastalıkları önlemeyi ve tedavi etmeyi amaçlar. mRNA ilaçları, güvenlik, verimlilik ve kısa döngü gibi avantajlara sahiptir. Aynı anda humoral ve hücresel bağışıklığı harekete geçirebilirler ve tümörler, bulaşıcı hastalıklar, nadir hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve daha fazlası dahil olmak üzere çeşitli endikasyonlarda uygulanmışlardır.
mRNA ilaç geliştirme sürecinin tamamı kabaca birkaç adıma ayrılabilir:
Dizi belirleme ve tasarımı—in vitro mRNA transkripsiyonu—kapsülleme hazırlığı
The geleneksel mRNA in vitro transkripsiyonunun (IVT) adımları şunları içerir:
Plazmit DNA ekstraksiyonu ve doğrusallaştırma—Plazmit DNA saflaştırması—In vitro transkripsiyon (ko-transkripsiyonel kaplama) —Saflaştırma —mRNA stok çözeltisi
The tek kap mRNA in vitro transkripsiyon (IVT) süreci şunları içerir:
Plazmit DNA ekstraksiyonu ve doğrusallaştırma—In vitro transkripsiyon (ko-transkripsiyonel kaplama)—Saflaştırma—mRNA stok çözeltisi
Şu anda, mevcut süreçlerin çoğu, IVT adımından önce enzimatik bölünmeden sonra plazmid DNA için tek bir saflaştırma adımını içerir. Olgun bir mRNA uygulama geliştirme merkezine dayanan Yeasen Biotechlogy, "Onepot mRNA Transkripsiyonu" sürecini geliştirmiştir. Bu süreçte, dairesel plazmid DNA'sı enzimatik bölünmeden sonra saflaştırılmaz; bunun yerine, doğrudan in vitro transkripsiyon için kullanılır ve yüksek kaliteli bir mRNA stok çözeltisi elde edilir. Tüm bu süreç, ürün ve süreç kalitesini garanti altına alırken, mevcut sürecin süresini kısaltır.
İşlem avantajları:
- Proses optimizasyonu, daha basit operasyon için IVT adımlarının azaltılması.
- Daha düşük malzeme maliyetleri, ayırma sonrası arıtma ve kalite kontrol ihtiyacını ortadan kaldırır.
- mRNA kalitesinin ve veriminin korunması.
Veri:
1. Verimler ve Bütünlük:
Kullanımı 1 μg doğrusallaştırılmış 2K, 4K ve 9K plazmitler, onepot işlemiyle 150-200 μg mRNA üretilebiliyor.
| Uzunluk | Verimler | Bütünlük |
| 2K | 200 mikrogram | 94.00 % |
| 4K | 185 mikrogram | %92,20 |
| 9 bin | 150 mikrogram | 87.50 % |
2K, 4K ve 9K uzunluğundaki parçaların bütünlüğünü değerlendirmek için kapiler elektroforez (CE) kullanılarak bütünlük testi yapıldı. 2K ve 4K parçaların bütünlüğü >%92, 9K parçaların bütünlüğü ise >%87 idi.
2. mRNA Kapaklama Verimliliği Tespiti
2K dizisinin kapatma verimliliğini değerlendirmek için LC-MS kullanıldı ve %99,5'lik bir kapatma verimliliği ortaya çıktı.
Üstteki resim: HPLC UV kromatogramı
Alttaki resim: Ayrıştırılmış moleküler ağırlık spektrumu
3. mRNA Poliadenilasyon Verimliliği Tespiti
Numunelerin poliadenilasyon etkinliğini saptamak için LC-MS kullanıldı ve sonuçların normal dağıldığı görüldü.
Üstteki resim: Sıvı kromatografisi TİK kromatogramı
Alttaki resim: Ayrıştırılmış moleküler ağırlık spektrumu
4.mRNA Ekspresyonu Deneme
Hem mRNA ürünleri hem de her ikisi kullanılarak sentezlenen 293T hücrelerinin transfeksiyonu geleneksel işlem (Solda, doğrusallaştırılmış plazmitler w(i. arınma) ve tek kapta yapılan işlem (Sağ, saflaştırma yapılmadan doğrusallaştırılmış plazmitler) 24 saatlik kültürden sonra floresan protein ifadesinde hiçbir fark göstermedi.
Sipariş Bilgileri