T7 Yüksek Verimli RNA Sentezi Kiti transkripsiyon reaksiyon sistemini optimize eder. Kit, T7 RNA polimerazı, şablon olarak T7 promotör dizisine sahip doğrusal çift sarmallı DNA ve promotörün aşağı akışındaki DNA dizisini kontrol etmek için substrat olarak NTP'leri kullanarak tek sarmallı RNA'yı verimli bir şekilde sentezleyebilir. Transkripsiyon sırasında, biyotin veya boya etiketli RNA hazırlamak için substrata modifiye nükleotidler eklenebilir.

1. T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kitinin Tanıtımı
2. İlkeler in vitro transkripsiyon
3. Yeasen T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kitinin Avantajları
4. Ürün performansı
5. Bu kit nasıl kullanılır?
6. Sıkça Sorulan Sorular
7. Sipariş Bilgileri

1. T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kitinin Tanıtımı

T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti hem uzun transkriptleri hem de kısa transkriptleri sentezleyebilir ve RNA, 1 μg DNA şablon girişiyle 100-200 μg üretilebilir. Sentezlenen RNA, RNA yapısı ve işlevi araştırması, RNase koruması, prob hibridizasyonu, RNA interferansı, mikroenjeksiyon ve in vitro çeviri.

2. İlkeler in vitro transkripsiyon

Şekil 1. In vitro transkripsiyon süreci

3. Yeasen T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kitinin Avantajları

Son derece yüksek verimler—2 saatte 200 µg'a kadar
Çok yönlü—20nt-10000nt RNA transkriptleri için uygundur
Çoklu kullanımlar—etiketlenmemiş, etiketlenmiş veya kapatılmış RNA üretir

4. Ürün performansı

Şekil 2. IVT verim karşılaştırması

Not: Tüm reaksiyon reaktifleri şuradan alınmıştır: T7 RNA Sentezi Kiti (Yeasen#10623 veya B* şirketi). Yeasen ve B* şirketinin IVT reaksiyon verimleri yukarıda gösterilmiştir.

Şekil 3. Farklı uzunluklardaki transkripsiyonel ürünlerin kalitesi

Şekil 4. HEK-293 hücrelerinde transkripsiyonlu mRNA'nın ifade düzeyi

Not: mRNA, Vaccinia Kapanma Enzimi (Yeasen#10614/10615) ile Kapanmıştır

5. Bu kit nasıl kullanılır?

5.1 Çözme reaktifleri

T7 RNA Polimeraz Karışımını kısa bir süre santrifüj edin ve buz üzerine koyun. 10× Transkripsiyon Tamponunu ve ribonükleotidleri (ATP, CTP, GTP, UTP) çözün, karıştırın ve tüpün dibine kadar santrifüj edin, 10× Transkripsiyon Tamponunu oda sıcaklığına koyun ve dört tip ribonükleotidi buza koyun.

5.2 Transkripsiyon reaksiyon sistemini aşağıdaki tabloya göre hazırlayın

Tablo 1.Transkripsiyon reaksiyon sisteminin hazırlanma yöntemi

Not:
a) Reaksiyon oda sıcaklığında hazırlanır. 10× Transkripsiyon Tamponu spermidin içerdiğinden, düşük sıcaklıklarda çok yüksek spermidin konsantrasyonu DNA şablonunun çökmesine neden olur.
b) Kısa transkript (<100 nt), 2 µg şablon kullanılabilir, transkripsiyon süresi 4-8 saate çıkarılabilir.
c) Uzun transkriptler (>1000 nt) için transkripsiyonda doğrusallaştırılmış plazmit şablonlarının kullanılması önerilir.
d) Reaksiyon çözeltisinin uzun süre buharlaşmasını önlemek için reaksiyonu PCR cihazında sıcak kapak açık şekilde gerçekleştirin.
e) Reaksiyon ürünü beyaz bir çökeltiye sahip olabilir. Bu, reaksiyon sırasında serbest pirofosfat ve magnezyum iyonları tarafından oluşturulan magnezyum pirofosfattır ve sonraki deneyleri etkilemez. Bunu gidermek için EDTA ekleyebilirsiniz. EDTA'nın eklenmesinin sonraki deneyleri etkileyip etkilemeyeceğinden endişe ediyorsanız, üstteki sıvı santrifüjleme ile de geri kazanılabilir.
f) Reaktifler ve kaplar RNase kontaminasyonundan uzak olmalıdır.

5.3 37°C'de 2 saat inkübe edin

Yukarıdaki reaksiyon solüsyonunu karıştırın, tüpün dibine kadar kısa bir süre santrifüj edin ve 37°C'de 2 saat inkübe edin. Transkript uzunluğu 100 nt'den azsa, reaksiyon süresini 4-8 saate çıkarın.

5.4 DNase I tedavisi (isteğe bağlı)

Reaksiyon tamamlandıktan sonra her tüpe 2 μL DNase I (RNase içermeyen) ekleyin ve şablon DNA’yı çıkarmak için 37°C’de 15 dakika inkübe edin.

6. Sıkça Sorulan Sorular

6.1 IVT reaksiyonunun verimi düşüktür

Şablon kalitesi verimle yakından ilişkilidir. Deney grubunun verimi pozitif kontrol grubundan önemli ölçüde düşükse, olası nedenler şunlar olabilir.
① Şablonlar IVT reaksiyonunu inhibe edecek bileşenler içerir.
② Şablonlarda bir sorun var.

6.2 Öneriler

① Şablonu tekrar arındırın.
② Şablonların konsantrasyonunu ve bütünlüğünü doğrulayın.
③ Tepkime süresini uzatın.
④ Şablonun girdisini artırın.
⑤Diğer RNA polimerazları ve karşılık gelen promotörleri deneyin.

6.3 Kısa transkriptlerin verimi düşüktür

Hedef transkriptler 100 nt’den kısa ise reaksiyon süresini 4-8 saate uzatın veya 20 μL reaksiyon sisteminde şablon girişini 2 ug’a çıkarın.

6.4 Beklenmeyen şekilde daha uzun transkriptler var

Jel elektroforezi sonucu beklenmedik şekilde daha uzun transkriptler gösteriyorsa olası nedenler şunlar olabilir:
① Plazmit şablonları tam olarak doğrusallaştırılmamış olabilir.
②Şablonlar 3' çıkıntılı, tutarlı uçlara sahiptir.
③Transkriptlerin tamamen bozulmamış ikincil bir yapısı vardır.

6.5 Öneriler

①Plazmid şablonlarının tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, plazmid doğrusallaştırmasını tekrar gerçekleştirin.
②Plazmit şablonlarını doğrusallaştırmak için uygun restriksiyon enzimlerini seçin ve 3' çıkıntılı kohezif uçlar üretmekten kaçının. Gerekirse kör bir uç üretmek için Klenow fragmanı veya T4 DNA polimerazı kullanmak uygulanabilir.
③Transkriptleri tespit etmek için denatüre jel kullanın.

6.6 Beklenmeyen şekilde daha kısa metinler var

Jel elektroforezi sonucunda beklenmedik şekilde daha kısa transkriptler ortaya çıkarsa olası nedenler şunlar olabilir:
①Şablonlarda T7 RNA polimerazının sonlanma dizisine benzer bir dizi bulunmaktadır.
②Şablonların GC içeriği yüksektir.

6.7 Öneriler

①Tepkime sıcaklığını azaltın (örneğin 30℃) ancak bazen reaksiyon sıcaklığının azaltılmasının verimi azaltacağını unutmayın.
②IVT reaksiyonunu katalize etmek için diğer RNA polimerazları deneyin.
③Şablonların GC içeriği yüksekse, verimi ve transkript uzunluğunu artırmak için IVT reaksiyon sıcaklığını 42℃'ye ayarlayın veya IVT reaksiyon sistemine SSB ekleyin.

6.8 Jel elektroforezi sırasında transkriptlerde bulaşma var

Jel elektroforezi sırasında transkriptlerde bulaşma varsa olası nedenler şunlar olabilir:
①Deneysel işlem sırasında RNase kontaminasyonu vardır.
②DNA şablonları RNazlar tarafından kirletilmiştir.

6.9 Öneriler

①Tüm reaktiflerin RNase içermeyen H2O ile formüle edildiğinden emin olun. RNase içermeyen pipet uçları ve Eppendorf tüpleri kullanın ve deneysel çalışma sırasında tek kullanımlık lateks eldivenler ve maskeler takın.
②DNA şablonlarını yeniden saflaştırın.

7. Sipariş Bilgileri

Aşağıda Yeasen tarafından sunulan temsili ürünler yer almaktadır. Ek boyutlar mevcuttur. Ürünlerimiz, üstün performans ve yeniden üretilebilirliği garanti altına almak için uyumlu bir şekilde çalışmak üzere son derece optimize edilmiştir.
Ayrıca özelleştirilmiş hizmetler de sağlayabiliriz. Gösterilmeyen bir ürünle ilgileniyorsanız bizimle iletişime geçin, ihtiyaçlarınızı karşılamak için sizinle birlikte çalışalım.

Tablo 2.Ürün bilgisi

Okuma ile ilgili olarak:

mRNA in vitro sentezi için GMP dereceli reaktifler

Yeasen Biyoteknoloji GMP Sınıfı mRNA In Vitro Sentez Hammaddeleri