Pandemi sırasında iyi sonuçlar elde etmesine ve büyük potansiyel göstermesine rağmen, mRNA teknolojisi hala kısa ifade süreleri ve sınırlı protein çevirisi gibi birkaç sınırlamaya sahiptir. Bu özellikler belirli bir düzeyde güvenlik sağlayabilse de, protein replasmanı gibi terapiler için sınırlamalar haline gelir. Bu, protein ifade düzeylerini korumak için tekrarlanan dozlama gerektirir ve immünojenisite ve nötralize edici antikorlar gibi yeni riskler ve zorluklar ortaya çıkarır.
Kendi kendini güçlendiren RNA (saRNA), geleneksel mRNA'dan yüzlerce hatta binlerce kat daha küçük dozlarda aynı bağışıklık tepkisini üretebilir. Daha düşük dozlar daha düşük üretim maliyetleri anlamına gelir ve daha az sıklıkta enjeksiyonlar, mRNA ve iletim vektörlerinden kaynaklanan potansiyel toksik yan etkileri azaltabilir. Şu anda, birkaç saRNA adayı dünya çapında klinik çalışmalara girmiştir. BioNTech gibi büyük şirketler aktif olarak saRNA teknoloji hatları geliştirmektedir.
saRNA önemli maliyet ve güvenlik avantajları sunsa da, benzersiz yapısı yeni üretim zorlukları sunar. RNA polimerazını kodlayan diziyi hedef protein dizisiyle birleştiren saRNA molekülü, geleneksel mRNA'dan çok daha büyük (~10kb) ve daha karmaşıktır (daha fazla ikincil yapı içerir). Bu, in vitro transkripsiyon reaksiyonlarının zorluğunu önemli ölçüde artırarak saRNA üretiminin verimini ve saflığını azaltır. Bu nedenle, saRNA üretimi sentez, ayırma ve saflaştırma süreçlerinde daha yüksek standartlar gerektirir.
Ayırma ve saflaştırma için kullanılan bir yöntem olan afinite kromatografisi, düşük hedef ürün verimi ve bütünlüğü gibi sorunlara sahiptir. Birden fazla kromatografik saflaştırma yöntemini birleştirmek (örneğin, selüloz kromatografisi, hidrofobik ters faz kromatografisi eklemek) zahmetlidir, yeni safsızlıklar getirir, düşük geri kazanım oranlarına sahiptir ve maliyetlidir. Ek olarak, büyük ölçekli üretim için kullanılan IVT reaksiyon sistemi, 100 nt nükleik asit dizilerini sentezlemeye uygun sistemlerden optimize edilmiştir ve bu da onu 10 kb'yi aşan boyuttaki saRNA için uygunsuz hale getirir. Bu, mevcut IVT reaksiyon sistemlerinin optimize edilmesini gerektirir. Şu anda, geleneksel mRNA saflaştırma yöntemleri endüstriyel ham sıvı kalite gereksinimlerini karşılayamaz. Bu nedenle, kendi kendini çoğaltan RNA için eksiksiz ve verimli bir endüstriyel sınıf ayırma ve saflaştırma süreci geliştirmeye ve optimize etmeye acil ihtiyaç vardır.
Endüstriyel Üretim ve Arıtma Yöntemlerinin Optimizasyonu
Kendi kendini çoğaltan mRNA (saRNA) için endüstriyel bir üretim sistemi geliştirmek için, öncelikle IVT kotranskripsiyon sistemindeki tampon iyon tiplerini ve bileşenlerini küçük ölçekte optimize etmek esastır. Bu ayrıca, kromatografik tamponun ve numune yıkama oranlarının akış aşağısı saflaştırma süreçleri için rafine edilmesini de içerir. Bu optimize edilmiş koşullar daha sonra sistemin üretim kapasitesini etkili bir şekilde artırıp artıramayacağını ve ham ürünün kalitesini iyileştirip iyileştiremeyeceğini doğrulamak için büyük ölçekli üretime ölçeklenebilir.
Kotranskripsiyon Kapak Ekleme Reaksiyon Sistemi
Kotranskripsiyon başlığı ekleme reaksiyon sisteminde, T7 tampon bileşenleri 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT ve Mg2+ tuzlarını içerir.
T7 Tamponu - Magnezyum İyon Tuzu Tipi
Kullanılan magnezyum iyon tuzunun türü, hedef saRNA ürününün verimini ve bütünlüğünü etkiler.
- 1 mg mRNA'nın küçük ölçekli kotranskripsiyon sentezi için, Mg2+ tuzu olarak Mg(OAc)2 kullanılması, sırasıyla 100,5 µg ve %62,9 değerleriyle en iyi verimi ve bütünlüğü sağlar.
- Buna karşılık, MgCl2 ve MgSO4 gibi diğer magnezyum iyon tuzlarının kullanılması verimi yaklaşık %25-50, bütünlüğü ise yaklaşık %10 oranında azaltarak hem verimi hem de bütünlüğü önemli ölçüde düşürür.
T7 Tamponu - Magnezyum İyon Konsantrasyonu
Magnezyum asetat iyonlarının optimum konsantrasyonu (30-50 mM), hedef saRNA'nın verimini ve bütünlüğünü artırır; en iyi sonuçlar 35 mM'de elde edilir.
- Magnezyum asetat iyon konsantrasyonu 30-50 mM olduğunda saRNA verimi 88,5-100,5 µg'a ulaşırken, bütünlük %58,6-62,9 olup iyi sonuçlar vermektedir.
- 35 mM konsantrasyonda verim ve bütünlük en yüksek seviyede olup sırasıyla 100,5 µg ve %62,9'a ulaşmaktadır.
T7 Tamponu - Diğer Tuzlarla Birleştirilmiş Magnezyum İyon Tuzu
T7 tamponuna diğer tuzların eklenmesi hedef ürünün verimini ve bütünlüğünü önemli ölçüde artırabilir.
- Temel T7 tamponu 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT ve Mg2+ tuzlarını içerir ve sırasıyla 100,5 µg verim ve %62,9 bütünlük elde edilir.
- İkinci bir tuz olan NaOAc'nin eklenmesi verimi ve bütünlüğü daha da artırır: verim 20-110 µg artar ve bütünlük yaklaşık %2-8 oranında iyileşir.
T7 Tamponu - Birleşik Tuzların Konsantrasyonu
İkinci tuz bileşeni NaOAc (Na+) 5-30 mM konsantrasyonunda olduğunda, hedef saRNA verimi ve bütünlüğü önemli ölçüde iyileşiyor ve en iyi konsantrasyon 15 mM'de gerçekleşiyor.
- 3-30 mM Na+ konsantrasyonlarında saRNA verimi 120-210 µg'a ulaşırken, bütünlük %64,4-70,2 olup iyi sonuçlar göstermektedir.
- 15 mM'lik bir Na+ konsantrasyonunda verim ve bütünlük en yüksek seviyede olup sırasıyla 210 µg ve %70,2'ye ulaşmaktadır.
Tek Saflaştırma Yöntemleri
Küçük ölçekli (<50 mg) saRNA üretimi ve saflaştırması sırasında, farklı saflaştırma yöntemlerinin kullanılması dsRNA içeriğini ve protein kalıntılarını önemli ölçüde azaltabilir, yüksek verim, kapatma verimliliği ve ürün bütünlüğü sağlayabilir. Saflaştırma yöntemlerinin en iyiden en kötüye doğru etkinliği: afinite kromatografisi > lityum klorür çökeltmesi > ultrafiltrasyon, selüloz kromatografisi.
-
Afinite Kromatografisi
Büyük ölçekli mRNA üretimi için kromatografi tercih edilir. Seçenekler arasında ters faz, iyon değişimi, hidrofobik ve afinite kromatografisi bulunur ve her birinin kendine göre avantajları ve dezavantajları vardır. Genellikle poli(A) mRNA'yı yakalamak için kullanılan afinite kromatografisi, %90'dan fazla geri kazanım oranına sahip ölçeklenebilirlik ve platform çözümleri sunar.
mRNA'nın temel yapısal özellikleri olan 5' başlık ve 3' poli(A) kuyruğu, saflaştırmayı kolaylaştırır. Manyetik boncuk saflaştırmasına benzer afinite kromatografisi, poli(A) kuyruk mRNA'sını yakalamak için dT bağlantılı boncuklar kullanır. Yüksek tuz koşulları negatif yükleri korur, AT hidrojen bağları aracılığıyla bağlanmaya izin verir ve mRNA hafif nötr pH ve düşük iletkenlik altında elüe edilir.
RNA için afinite kromatografisi "yüksek tuz bağlama, düşük tuz elüsyonu" içerir. Tampon bileşimi, moleküler boyut, sıcaklık ve örnek konsantrasyonu süreci önemli ölçüde etkiler. Deney yoluyla optimum tuz tipini ve konsantrasyonunu seçmek, verimli saflaştırma için esastır.
Saflaştırma: Bu yöntem en yüksek ürün bütünlüğünü (%80,3), en düşük dsRNA içeriğini (0,01 µg/mg), en yüksek kapatma verimliliğini (%96,4) ve en az protein kalıntısını (1,20 µg/mg) sağlar, 136 µg verim ve %65 geri kazanım oranı ile ürün saflığı ve kalitesi açısından en iyisidir.
-
Diğer Arıtma Yöntemleri:
Lityum Klorür Çökelmesi
LiCl kullanılarak mRNA'nın saflaştırılmasının prensibi, lityumun belirli bir pH'ta moleküller arasındaki elektrostatik itmeyi azaltarak verimli bir RNA çökelmesine olanak sağlamasıdır.Çökelti daha sonra santrifüjleme ile ayrılır ve saf bir RNA örneği elde etmek için çözülür. LiCl çökeltmesi çeşitli boyutlardaki mRNA'lar için basit, hızlı ve etkilidir ve yüksek saflıkta ürünler verir. Ancak, kalan lityum iyonları mRNA'yı inhibe edebilir. Saflaştırma verimliliğini sağlamak için en az 400 µg/ml RNA içeren çözeltiler için LiCl çökeltmesi kullanılması önerilir. Bu yöntem yüksek bir verim (210µg) üretir, ancak ürün bütünlüğü yalnızca %70,2'dir ve bu da ürün kalitesini önemli ölçüde azaltır. Büyük ölçekli üretim için uygun değildir.
Manyetik Boncuk Yöntemi：
Manyetik boncuklar, tipik olarak bir demir oksit çekirdek ve dış bir kaplamadan oluşan, manyetik bir alan altında yönsel olarak hareket eden küçük parçacıklardır. Manyetik boncuk saflaştırma, karışımlardan mRNA moleküllerini hızlı ve etkili bir şekilde zenginleştirmek için yaygın bir moleküler biyoloji tekniğidir. Farklı işlevsel manyetik boncuklar, çeşitli biyomolekülleri saflaştırmak için farklı yüzey işlevsel gruplarına (örneğin, hidroksil, karboksil, Oligo(dT), streptavidin) sahiptir.
Karboksillenmiş manyetik boncuklar, mRNA moleküllerinin asidik koşullar altında elektrostatik etkileşimler yoluyla bağlanmasıyla nükleik asitleri etkili bir şekilde saflaştırabilir. Koşulların ayarlanması, mRNA'nın seçici olarak bağlanmasına ve salınmasına olanak tanır. Daha fazla negatif yüklü fosfat grubuna sahip daha uzun mRNA'lar boncuklara daha kolay bağlanır. Daha kısa mRNA'lar için daha büyük boncuk hacimlerine ihtiyaç duyulabilir. Afinite kromatografisine benzer şekilde Oligo(dT)-eşlenmiş manyetik boncuklar, mRNA'nın poli(A) kuyruğu ile boncukların Oligo(dT)'si arasındaki spesifik bağlanmayı kullanır.
Ultrafiltrasyon
Bu yöntem, afinite kromatografisine göre yaklaşık %8 daha düşük olan en düşük saRNA bütünlüğüne ve en yüksek protein kalıntısına (4,58 µg/mg) neden olur.
Selüloz Kromatografisi
Bu yöntem düşük dsRNA içeriği (0,009 µg/mg) ve yüksek bir kapatma oranı (%96,4) elde eder. Ancak, protein kalıntıları biraz daha yüksektir (5,30 µg/mg), sadece %57'lik bir geri kazanım oranı ve 120 µg'lık bir verim vardır, bunların her ikisi de afinite kromatografisiyle elde edilenlerden önemli ölçüde daha düşüktür (sırasıyla yaklaşık %10 ve 16 µg).
Arıtma İşlemi
Kromatografik Tampon Bileşenleri - İndirgeyici Maddelerin Eklenmesi
Saflaştırma sırasında kromatografik tampona indirgeyici maddeler eklemek, indirgeyici maddeler eklememeye kıyasla ürün bütünlüğünü, geri kazanım oranını ve kapatma verimliliğini önemli ölçüde artırabilirken, yan ürün dsRNA ve protein kalıntılarının seviyelerini azaltabilir.
- Azaltıcı Maddeler Olmadan:
- Verim: 136µg
- Kurtarma Oranı: %65
- Dürüstlük: %80,3
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 1,20 µg/mg
- Ürün saflığı ve kalitesi iyidir.
- İndirgeyici Maddelerle (TCPE, DTT, β-merkaptoetanol):
- Verim 10-40µg artar
- Kurtarma Oranı %5-18 oranında artar
- Dürüstlük yaklaşık %1-5 oranında iyileşir
- Kapak Verimliliği: %96,4
- dsRNA: 0,005 µg/mg kadar düşük
- Protein Kalıntısı: 0,20 µg/mg kadar düşük
- Ürün saflığında ve kalitesinde önemli iyileşme.
Kromatografik Tampon Bileşenleri - İndirgeyici Maddelerin Türleri
Kromatografik tampona eklenen farklı tipte indirgeyici maddeler, dsRNA ve protein kalıntılarını azaltırken ürün bütünlüğünü, geri kazanım oranını ve kapatma verimliliğini daha da iyileştirebilir. TCPE'nin en etkili indirgeyici madde olduğu bulunmuştur.
- TCPE ile:
- Verim: 175µg
- Kurtarma Oranı: %83
- Dürüstlük: %85,2
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 0,20 µg/mg
- Mükemmel ürün saflığı ve kalitesi.
Kromatografik Tampon Bileşenleri - İndirgeyici Maddelerin Konsantrasyonu
Kromatografik tampona 5-15 mM konsantrasyonda indirgeyici ajanlar eklemek, dsRNA ve protein kalıntılarını azaltırken ürün bütünlüğünü, geri kazanım oranını ve kapatma verimliliğini önemli ölçüde iyileştirebilir. Optimum konsantrasyon 10 mM'dir.
- 5-15mM TCPE ekleniyor:
- Verim: 160-178µg
- İyileşme Oranı: %76-85
- Dürüstlük: yaklaşık %85
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 0,20-0,52 µg/mg
- Ürün saflığı ve kalitesi iyi.
- 10mM TCPE ile:
- Verim: 178µg
- Kurtarma Oranı: %85
- Dürüstlük: %85,4
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 0,20 µg/mg
- Optimum ürün saflığı ve kalitesi.
Yıkama Oranı
Yıkama sürecinde kromatografik tamponun enjeksiyon suyuna oranının kontrol edilmesi (10-25):(75-90), dsRNA ve protein kalıntılarını azaltırken ürün bütünlüğünü, geri kazanım oranını ve kapatma verimliliğini önemli ölçüde iyileştirebilir. En uygun oran 15:85'tir.
- Oran (10-25):(75-90):
- Verim: 150-179µg
- İyileşme Oranı: %71-85
- Dürüstlük: %84-90
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: yaklaşık 0,20 µg/mg
- Ürün saflığı ve kalitesi iyi.
- 15:85 Oranıyla:
- Verim: 179µg
- Kurtarma Oranı: %85
- Dürüstlük: %90.0
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 0,20 µg/mg
- Optimum ürün saflığı ve kalitesi.
Kombine Arıtma Yöntemleri
Farklı saflaştırma yöntemlerinin bir kombinasyonunun kullanılması, üründeki dsRNA ve protein kalıntılarının seviyelerini daha da düşürebilir ve genel kaliteyi artırabilir. Saflaştırma yöntemlerinin tercih edilen sırası şudur: afinite kromatografisi > ultrafiltrasyon + afinite kromatografisi > afinite kromatografisi + selüloz kromatografisi > selüloz kromatografisi + ultrafiltrasyon. Sadece afinite kromatografisi en iyi sonuçları sağlar.
-
Sadece Afinite Kromatografisi:
- Verim: 179µg
- Kurtarma Oranı: %85
- Dürüstlük: %90.0
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapak Verimliliği: %96,4
- Protein Kalıntısı: 0,20 µg/mg
- En yüksek ürün saflığı ve kalitesi.
-
Ultrafiltrasyon + Afinite Kromatografisi:
- Verim: 170 µg (sadece afinite kromatografisinden 9 µg daha az)
- Geri Kazanım Oranı: %81 (sadece afinite kromatografisinden %4 daha az)
- Dürüstlük: %88,5
- dsRNA: 0,0015 µg/mg
- Protein Kalıntısı: 0,18 µg/mg
- Sadece afinite kromatografisine kıyasla dsRNA ve protein kalıntılarında hafif azalma, ancak verim ve geri kazanım oranında önemli azalma. Bu yöntem daha karmaşıktır, saflaştırma süresini iki katına çıkarır ve maliyetleri artırır.
-
Afinite Kromatografisi + Selüloz Kromatografisi / Selüloz Kromatografisi + Ultrafiltrasyon:
- dsRNA: tek yöntemlerden 0,005 µg/mg daha düşük
- Verim: 60-100µg daha az
- Kurtarma Oranı: %30-40 daha düşük
- Adım sayısının artması işçilik ve malzeme maliyetlerinin artmasına neden olur.
Büyük Ölçekli Üretim
Büyük ölçekli üretimde, afinite kromatografisi, selüloz kromatografisiyle birleştirilmiş afinite kromatografisi veya afinite kromatografisiyle birleştirilmiş ultrafiltrasyon kullanılarak, kendi kendini çoğaltan mRNA verimi %67-88'lik bir geri kazanım oranıyla önemli ölçüde 140-185 µg'a çıkar. Ürün bütünlüğü %93-94'tür, dsRNA içeriği 0,0018-0,0020 µg/mg içinde kontrol edilir, kapatma verimliliği %96,1-96,4'e ulaşır ve protein kalıntıları 0,04-0,05 µg/mg içinde tutulur. Bu, büyük ölçekli üretim için iyi ölçeklenebilirlik ve verimlilik gösterir.
Referans:
[8] Kendi Kendini Güçlendiren mRNA Ham Sıvısının Endüstriyel Üretimi ve Ayırma Saflaştırma Yöntemleri ve Uygulamaları [P]. Patent: CN118048418A. 2024.05.17.
Sipariş Bilgileri
Yeasen, mRNA sentezi için birinci sınıf bir enzim olan yeni bir CleaScrip™ T7 RNA Polimerazı geliştirdi. bunun için dsRNA'nın çıkarılması için selüloz işlemine gerek kalmaz, bu da hem zamandan hem de işçilik maliyetlerinden tasarruf sağlar. CleaScript™ T7 RNA polimerazı tarafından üretilen mRNA'lardaki dsRNA içeriği, selüloz işlemi kullanılarak dsRNA çıkarma adımından hem önce hem de sonra Wild Type T7 RNA Polimerazı tarafından üretilen mRNA'lardakinden daha düşüktür. Daha fazla ayrıntıya göz atın Aşağıdaki bağlantılardan: