Cap yapısı, mRNA aşılarının ve terapötiklerinin geliştirilmesinde önemli bir bileşendir. Sentetik mRNA teknolojisi, toll benzeri reseptörler (TLR'ler) ve diğer bağışıklık sensörleri tarafından mRNA'nın doğuştan bağışıklık tarafından tanınmasını azaltarak ve stabiliteyi, translasyonel verimliliği artırarak istenmeyen bağışıklık aktivasyonunu en aza indirmek için Cap1'e güvenir. Bu, istenmeyen inflamatuar yanıtları önler ve böylece insan hücrelerindeki terapötik mRNA'nın stabilitesini ve etkinliğini artırır.
Erken Keşif ve Cap0 Yapısı
1970'lerin ortalarında, ökaryotik mRNA üzerine yapılan araştırmalar, bir N7-metilguanozin başlığının (m7G) 5'-ucundaki ilk nükleotide bağlandığı, artık Cap0 olarak bilinen 5' terminal yapısını ortaya çıkardı. Bu modifikasyonun, mRNA'yı ekzonükleazlar tarafından parçalanmaktan koruduğu, nükleer ihracata yardımcı olduğu ve çeviri başlatma için ribozom tanınmasını desteklediği bulundu. Cap0, metilasyonu guanozin başlığının kendisiyle sınırlı olan ilk karakterize edilmiş başlık yapısıydı. Bu 5'-başlığın ve işlevlerinin keşfi, ökaryotik mRNA başlıklarının ve mRNA modifikasyonlarındaki rollerinin anlaşılmasında önemli bir atılımı işaret ediyordu.
Cap1'in Ortaya Çıkışı
Ökaryotik mRNA'nın kritik bir özelliği olan Cap1 yapısı, mRNA stabilitesi, translasyonu ve bağışıklık tanınmasında önemli bir rol oynar. 5'-5' trifosfat bağıyla ilk nükleotide bağlı bir N7-metilguanozinden (m7G) oluşan mRNA cap yapısı, 1970'lerde ökaryotik mRNA transkripsiyon sonrası modifikasyonları üzerine yapılan erken çalışmalardan evrimleşmiştir.
5'-uç başlıklı mRNA'ların yapısı.【1】 Daha ileri araştırmalar, çoğu ökaryotik mRNA'da, başlığı takip eden ilk nükleotidin (pozisyon +1) ribozun 2'-O pozisyonunda da metillendiğini, 2'-O-metilasyon olarak bilinen bir işlem olduğunu ortaya koydu. Cap1 yapısı (m7GpppNm) olarak bilinen bu keşif, mRNA modifikasyonlarına işlevsel açıdan başka bir önem katmanı ekledi. Cap1 modifikasyonunun mRNA stabilitesini ince ayarladığı ve özellikle memeli hücrelerinde, RIG-I, TLR'ler ve MDA5 gibi desen tanıma reseptörleri tarafından tanınmaktan kaçınmaya yardımcı olduğu, doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından bağışıklık tanınmasını önlediği bulundu.【2】. Bu, hem mRNA metabolizması hem de mRNA aşılaması ve gen terapisi uygulamaları dahil olmak üzere mRNA tabanlı teknolojilerin ilerlemesi için çok önemliydi.
mRNA Endüstrisindeki Teknik Zorluklar ve Güncel Çözümler
mRNA aşılarının yaygın uygulanması ve optimizasyonunda, yüksek doz mRNA, bağışıklık tepkileri, stabilite ve iletim sorunları da dahil olmak üzere çeşitli teknik zorluklar devam etmektedir. mRNA endüstrisindeki önemli bir zorluk, güçlü bir bağışıklık tepkisi uyandırmak için yüksek doz mRNA'ya ihtiyaç duyulmasıdır. Bunun birkaç nedeni vardır:
Hızlı Bozunma: mRNA doğası gereği kararsızdır ve biyolojik sistemlerde bulunan başlık çıkarma enzimleri ve ribonükleazlar (RNazlar) tarafından parçalanmaya karşı hassastır.
Sınırlı Çeviri Verimliliği: mRNA'nın proteine çevrilme verimliliği değişebilir ve bağışıklık tepkisi için yeterli antijen seviyeleri oluşturmak için daha yüksek miktarda mRNA gerekir. Çeviri verimliliği Cap1 ve çeviri başlatma faktörü eIF4E'nin afinitesi ile ilişkilidir.
Ökaryotlarda temel çeviri başlatma kompleksinin oluşumu.【3】
İmmünojenite ve İstenmeyen Bağışıklık Reaksiyonları: Üçüncü en büyük engel, özellikle dsRNA veya eksik mRNA için, mRNA'nın kendisi tarafından tetiklenebilen doğuştan gelen bağışıklık tepkisidir. Uyarlanabilir bağışıklık sistemini uyarmak için belirli bir düzeyde bağışıklık aktivasyonu istense de, aşırı aktivasyon, aşının etkinliğini azaltabilecek veya yan etkilere neden olabilecek inflamatuar tepkilere yol açabilir.
Kapaklama Teknolojisi Tarihi
-
Enzimatik Kaplama Teknolojisi: mRNA araştırmalarının ilk günlerinde tanıtılan enzimatik kapama, transkripsiyon sonrası doğal bir 5' başlığı eklemek için guanililtransferaz ve metiltransferaz gibi kapama enzimlerinin kullanılmasını içerir. Bu yöntem, özellikle terapötik uygulamalar için mRNA translasyonunda yüksek doğruluk ve kapama verimliliği sağlar.
-
Sentetik Kapak Analogları (1980'ler-2000'ler): Araştırmacılar, başlıklı mRNA'nın in vitro sentezi için sentetik başlık analogları geliştirdiler ve bu da mRNA işlevini ve gen ifadesini incelemeye yardımcı oldu. Anti-Ters Başlık Analogu (ARCA), mRNA sentezi sırasında yanlış başlık katılımını önlemek için tasarlanmış sentetik bir başlık analoğudur ve aşılar ve gen terapileri için mRNA'nın çeviri verimliliğini artırır. Ancak, ARCA başlıklamasının başlıklama verimliliği ve verimi düşüktür.
-
Cap1 Teknolojisi (2010'lar): mRNA sentezi sırasında doğrudan başlığı dahil ederek işlemi basitleştiren Cap1 ko-transkripsiyonel başlıklama yöntemi. Bu yöntem verimliliği artırır ve yüksek oranda doğru şekilde başlıklanmış mRNA üretir, bu da onu mRNA aşıları gibi büyük ölçekli terapötik uygulamalar için ideal hale getirir.
Günümüzde enzimatik kapatma teknolojileri, COVID-19 aşıları da dahil olmak üzere mRNA tabanlı tedavilerin geliştirilmesinde kritik öneme sahip olup, terapötik mRNA'nın stabilitesini ve etkili translasyonunu garanti altına almaktadır.
Enzimatik kaplamanın yeni nesil karşılaştırılması LZCap Capping ve birinci nesil Capping (ARCA) yöntemi
Yeni Nesil Cap Analoglarının Geliştirilmesi
Decap çıkarma enzimlerine dirençli, çeviri verimliliğini artırmak için eIF4E'ye yüksek afiniteli ve daha düşük immünojeniteli cap analogları geliştirmeyi amaçladık. Bu gelişmeler, kanser karşıtı tedaviler ve gen terapisi uygulamaları dahil olmak üzere mRNA tabanlı terapilerin etkinliğini artırmak için çok önemlidir.
LZCap'i Tasarlamak
LZCap'i tasarlarken, esas olarak eIF4E'ye yüksek afinitesi olan bir başlık analoğu yaratmaya odaklandık. Enzimler, substratları nispeten "özgül" bir şekilde tanır. Bu nedenle, yeni bir başlık yapısı tasarlarken, mümkün olduğunca doğal/bilinen yapılarla benzerliği korumaya çalışıyoruz. Doğal yapı, modifiye edilebilen (örneğin, metilasyon) bir riboz 3' OH'ye sahiptir. Bu düşünceye dayanarak, yenilik için 3' pozisyonuna bir karbon, ardından OH'nin hidrojen bağını taklit etmek için bir NH ve ardından NH'nin bazikliğini azaltmak ve hidrojen bağı yeteneğini artırmak için bir asetil grubu eklemeyi seçtik. LZCap'in aktivitesi, muhtemelen artan hidrojen bağı nedeniyle metillenmiş doğal başlıktan daha iyidir. Metil ve metoksi gruplarıyla karşılaştırıldığında, asetil amino grubu ayrıca substrat (başlık) ile başlatıcı faktör (enzim) arasındaki van der Waals etkileşimlerini artırabilir.
Asetil Amino Grubunun Stabilitesi
Asetil amino grubu zaten yeterince kararlıdır. Başlığın en az kararlı kısımları olan 7-metillenmiş pozisyon ve fosfodiester bağından çok daha kararlıdır.
LZCap'in Verimi ve Kapatma Verimliliği
LZCap AG(3'Acm) başlığıyla, lüsiferaz mRNA başlıklama etkinliği yaklaşık %97,59'dur ve T7 RNA polimerazı ile standart bir in vitro transkripsiyon (IVT) reaksiyonunda 1 μg DNA şablonuyla 200 μg'a kadar başlıklanmış mRNA elde edilebilir. Basit LiCl çökeltmesinden sonra mRNA saflığı %99'a kadar çıkar. Bu yüksek başlıklama etkinliği ve verimi LZCap'i protein üretimi ve gen terapisi dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için çekici bir seçenek haline getirir.
Cap yapısı, mRNA aşılarının ve tedavilerinin geliştirilmesinde önemli bir bileşendir.Sentetik mRNA teknolojisi, stabiliteyi, translasyonel verimliliği artırmak ve toll benzeri reseptörler (TLR'ler) ve diğer bağışıklık sensörleri tarafından mRNA'nın doğuştan bağışıklık tarafından tanınmasını azaltmak için Cap1'e güvenir ve istenmeyen bağışıklık aktivasyonunu en aza indirir. Bu, istenmeyen inflamatuar yanıtları önler ve böylece insan hücrelerindeki terapötik mRNA'nın stabilitesini ve etkinliğini artırır.
| Ürün | Şapka AG (3'-OBen-7mG) | LZ Başlığı AG(3'Acm) | AG (kapatma yok) |
| mRNA verimi (μg) | 164 | 173 | 200 |
RNAse H tabanlı yöntemle LZCapped Luciferase mRNA'nın kapatma etkinliğinin MS analizi. Kapatma etkinliği yaklaşık %97,59'dur,
mRNA'nın kapak çıkarma enzimine karşı stabilitesi nasıl?
LZCap AG (3'Acm) ve LZCap AG M6 (3'Acm) içeren mRNA'lar, başlık çıkarma enzimine (NEB) karşı daha yüksek direnç gösterir. CapM6'nın (3'-OMe-6mA-7mG) de başlık çıkarma enzimine karşı dirençli olduğu, ancak normal Cap AG'nin (3'-OMe-7mG) direnç göstermediği belirtilmiştir.
LZCap'in eIF4E'ye bağlanma afinitesi nasıldır?
LZCap AG(3'Acm) başlıklı mRNA'nın protein ekspresyonu nasıldır?
LZCap AG(3'Acm) başlıklı lüsiferaz mRNA'sının ifadesi, farklı hücre hatlarında* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T ve Huh7) Cap1 analogu (3'-OMe-7mG) başlıklı mRNA'sından önemli ölçüde daha yüksektir. 130 tekrarlı deney, LZCap AG(3'Acm) başlıklı lüsiferaz mRNA'sının (3'-OMe-7mG) başlıklı mRNA'sından ortalama olarak yaklaşık 1,5 kat daha yüksek bir ifadesini göstermiştir. Benzer sonuç farelerde de gözlemlenmiştir. Protein ifade seviyesi, farklı mRNA dizileriyle biraz değişebilir.
Hayvanlarla ilgili daha fazla veriniz var mı?
LZCap AG(3'Acm) veya LZCap AG(3'FMom) kapaklı ifade verimliliği
GLuc kodlayan mRNA, Cynomolgus Maymunu ve Domuzunda CapAG (3'-OMe-7mG) başlıklı mRNA'lara kıyasla daha yüksek bir in vivo ekspresyon göstermektedir.
LZCap AG başlıklı mRNA'ların doğuştan gelen immünogenitesi hakkında ne düşünüyorsunuz?
LZCapAG (3'Acm) başlıklı mRNA'lar düşük doğal immünogenite gösterir. TLR8, TLR7, IL-1A ve B, başlıksız RNA tarafından indüklenen bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynar. LZCapped mRNA immünogenite analizinin in vivo çalışmaları, başlıksız RNA'nın farelerde bağışıklık ile ilişkili faktörlerin transkripsiyon seviyesinde önemli değişikliklere neden olduğunu göstermiştir. Hem LZCap hem de 3'-OMe-7mG başlıklı mRNA'lar, tek bir RNA uyarılı enjeksiyondan sonra farelerde benzer şekilde daha düşük bağışıklık faktörü transkripsiyon seviyesi gösterir.
Güvenlik testi yaptınız mı?
Evet, Sitotoksisite Testi, İnsan Polimeraz İnhibisyon Çalışması ve Ames Testi yaptık.
- 293T, Huh7, MRC5, THP1 ve U87MG hücrelerinde 3'-Acm-7mG (CC50＞10000nM) nükleozid monomeri için hiç sitotoksisite gözlenmedi veya çok az gözlendi.
- İnsan DNA polimerazı ( α ,β , y ve Klenow) ve mitokondriyal RNA polimeraz (hPOLRMT) aktivitesi inhibisyon çalışmaları, 3'-Acm-7mG TP'nin insan DNA'sını veya RNA polimerazını inhibe etmediğini göstermektedir.
- Bakteriyel ters mutasyon testi (Ames), çoğu kemirgen ve insanda ilişkili genetik değişikliklerin yanı sıra genotoksik karsinojenleri de tespit eder. Ames testi, 3'-Acm-7mG'nin genotoksisitesinin olmadığını gösterdi.
Bu ürün patentli mi?
Evet. Patent ABD'de alındı.
Sipariş bilgileri
| Ürün Adı | Özellikler | Katalog No. |
| LZ Başlığı AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100μL, 1mL | 10684ES |
| LZ Başlığı AU(3'Acm)（ 100mM） | 100μL, 1mL | 10685ES |
| LZ Başlığı GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100μL, 1mL | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100μL, 1mL | 10688ES |
| LZ Başlığı AG(3'Ma-Cy7)（ 25mM） | 100μL, 1mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL, 1mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biyotin) (25 mM) | 100μL, 1mL | Sorgu |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL, 1mL | Sorgu |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
| LZCap (AG(3'Acm) Ateşböceği luc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL, 1mL | Sorgu |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | BENsoruşturma |
Referans:
- Koronavirüs RNA başlıklanması ve metilasyonunun moleküler mekanizmaları, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA aşıları — aşı biliminde yeni bir dönem. Nat. Rev. İlaç. Keşif. 17, 261–279 (2018).
- Memelilerde RNA Bağlayıcı Protein Tarafından Düzenlenen Çeviri Başlangıcı: Trans-Etkili Faktörler ve Hücreler Tarafından Çeviri Başlangıcı Kompleksinin Modülasyonu 2021, 10(7), 1711