Bu makalede Konkanavalin A'nın uygulaması ve manyetik boncuklarla kovalent kuplajı açıklanmaktadır.
Bölüm 1. Concanavalin A
Adından da anlaşılacağı gibi, Concanavalin A-Kaplamalı Manyetik Boncuklar (ConA boncukları), bitki lektini Concanavalin A'nın (ConA) süperparamagnetik nanomalzemelerle birleştirildiği biyomagnetik boncuklardır. Aşağıda ConA Manyetik Boncuklarına kısa bir giriş bulunmaktadır.
Kan grubu özgüllüğü olmayan bir bitki lektin proteini olan Konkanavalin A (ConA), 1936'dan bu yana mürekkep balığından (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) izole edilen, saflaştırılan ve kristalleştirilen ilk bitki lektin proteinidir.
ConA, içinde bulunduğu çözeltinin pH'ına bağlı olarak 2 ana forma sahiptir: α-2 homodimer veya α-4 homotetramer [2]. Alkali koşullar altında (pH>7.0) bir tetramer olarak bulunur (dört moleküler ağırlıkta 26 kDa alt birimden oluşur); asidik koşullar altında (pH 4.5-5.5) Con A aktif bir dimerik yapıya (52 kDa) ayrışır. Ek olarak, ConA'nın işlevi iki değerlikli katyonlardan etkilenir, örneğin metal iyonlarının yokluğunda (Ca2+ ve Mn2+), konformasyonu ve glikoprotein bağlama işlevi gerçekleştirilemez[1].
Şekil (1). (A) ConA monomeri, (B) ConA dimeri, (C) Mannoz, glikoz ve metal iyonları içeren ConA tetramerinin moleküler modellemesi.
Bölüm 2. Boncuklar
Biyomanyetik boncuklar, polimerler ve inorganik manyetik nanopartiküller tarafından oluşturulan nanometre parçacık boyutuna sahip bir manyetik mikroküre sınıfıdır. Manyetik boncuklar, yapılarına göre üç ana kategoriye ayrılabilir: çekirdek-kabuk tipi yapı, sandviç tipi yapı ve dağınık tip yapı. Manyetik malzemeler arasında saf demir tozu, karbonil demir, manyetik cevher, ortoferrit ve demir kobalt alaşımı bulunur. ve diğerleri.
Manyetik nanomalzemeler, küçük boyut etkisi, yüzey etkisi ve kuantum boyut etkisi gibi özel etkilerinden dolayı Fe boyutunda3O4 nanopartiküller 30 nm'den küçükse, nanopartiküllerin içindeki termal bozulmanın müdahalesi önemlidir ve bu sırada bu nanopartiküller özel bir manyetik özellik, yani süperparamanyetizma gösterir. Süperparamanyetik Fe3O4 Nanopartiküller, toksik olmama, iyi biyouyumluluk, benzersiz manyetik hedefleme özellikleri ve alternatif manyetik alanlarda ısı üretiminin kolaylığı gibi yüksek kaliteli özellikleri nedeniyle biyolojik endüstride yaygın olarak kullanılmaktadır.
Buna karşılık, biyomoleküllerin immobilizasyonu için ConA'nın mikrokürelerle kovalent olarak birleştirilmesinin aşağıdaki avantajları vardır:
- Tekrarlanabilirlik açısından kovalent kuplaj bağlanmasının yüksek kararlılığı;
- Hedef molekül etkileşimleri için mikroboncukların yüzeyine bağlanan Ligand ConA;
- Biyolojik deneysel manipülasyona uygun çözüm ortamının kinetik karakterizasyonu;
Bölüm 3. ConA manyetik boncukların uygulanması
Literatürde bildirildiği üzere, ConA manyetik boncuklarının başlıca uygulamaları sitoplazmik membran ayrımı, glikoprotein zenginleştirme ve immobilize edilmiş hücresel unsurların ayrımı olmak üzere 3 senaryoda kategorize edilmektedir.
Uygulama I: Sitoplazmik membran ayrımı
İki değerlikli katyonların aktivasyonundan etkilenen ConA manyetik boncukları kullanılarak, Ca'da bulunur2+ ve Mg2+ plazma membran saflaştırmasında kullanılan terminal α-D-mannosil ve α-D-glukozilin afinite etkileşimi işlevine sahip olan çözelti ortamları basit ve etkili bir yoldur. Örneğin, hücre veya dokuların plazma membran ayrımı, plazma membran proteinlerini daha fazla elde etmek için önemli bir adımdır. ConA, hücrelerdeki glikozlanmış proteinleri bağlayabilir ve bu prensip daha yüksek saflıkta plazma membranı elde etmek için kullanılabilir. Ana işlem adımları şunlardır: biyotinlenmiş ConA'yı streptavidin manyetik boncuklarına bağlayarak manyetik boncuklar üzerinde ConA'nın immobilizasyonu; hücre membranlarının 1 saat boyunca ConA manyetik boncuklarıyla inkübe edilmesi; manyetik bir rafta adsorpsiyon; TBS ile 5 kez yıkama; ve sitoplazmik membran çözeltisinin eluantla elüsyonu[3].
Şekil 2. Plazma membranı için ConA manyetik boncuk saflaştırma adımları
Uygulama II: Glikoprotein Zenginleştirme
ConA, mannoz ve glikoz için spesifiktir ve birçok serum ve hücre zarı glikoproteininin "çekirdek oligosakkaridi" olan α-konjuge mannozu tanır. Bu nedenle, hücre veya doku lizatları veya serumdaki glikoproteinler gibi glikozlanmış molekülleri ayırmak için immünolojide kullanılabilir.
Büyük bir prosedür şuydu: çapraz bağlanmış aminosilanize manyetik nanopireller (MNP'ler) ile ConA ile bifonksiyonel bağlayıcı, bis-N-hidroksisüksinimid linoleat (DSS) aracılığıyla, ConA manyetik boncukları elde etmek; metoksietilen glikol (MEG) kullanarak manyetik nanopirlerin spesifik olmayan bağlanmasını sonlandırmak ve manyetik ayırmayı gerçekleştirmek; tripsinle sindirilen hücre zarı proteinlerinin özünü ekleyerek hem ConA manyetik boncuklarını hem de yakalanan glikopeptitleri inkübe etmek ve son olarak yakalanan glikopeptitleri elüe etmek ve vakumla kurutma yapmak. ConA manyetik boncukları inkübe edildi, bağlanmış glikoproteinlere sahip ConA manyetik boncukları manyetik raf tarafından toplandı, glikopeptit olmayanlar yıkandı ve son olarak yakalanan glikopeptitler elüe edildi ve vakumla kurutuldu. Bu yöntem, tümörle ilişkili proteinlerin (örneğin, EGFR) spesifik glikozilasyon bölgelerinin derinlemesine analizine olanak tanır[4].
Şekil 3. Farklı lektinlere bağlı süperparamagnetik nanopartiküller
Uygulama III: Hareketsizleştirilmiş hücrelerin izolasyonu
Hücre zarları veya nükleer zarlar üzerindeki glikoproteinlere bağlanmak için ConA manyetik boncuklarının (yüksek saflıktaki eşlik eden Concanavalin A'ya kovalent olarak bağlı manyetik boncuklar) kullanımı, böylece hücreleri veya çekirdekleri yakalamak, az sayıda hücrenin deneysel manipülasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Örneğin, ConA manyetik boncukları CUT&Tag ve CUT&RUN'da kullanılır [5] Kromatinin yapısını ve işlevini incelemek için kullanılan yeni bir teknik olan deneyler, santrifüjlemenin neden olduğu hücre kaybı sorununu önlemek ve işlemi görselleştirmek için hücrelere ConA manyetik boncukları bağlanarak immobilize edilir.
DNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılan geleneksel ChIP-seq teknolojisiyle karşılaştırıldığında, CUT&Tag ve CUT&RUN'ın aşağıdaki avantajları vardır:
- ConA manyetik boncuklar, hücre zarı glikoproteinlerine bağlanarak operasyonu görselleştirir ve deneysel operasyon deneyimini geliştirir;
- Santrifüjlemeye gerek yok, hücre örneklerinin ve solüsyonların ayrılmasını tamamlamak için sadece manyetik rafa adsorbe edilen ConA manyetik boncuklar;
- Çok sayıda örneğe ihtiyaç duyulmadan, sadece 10 hücre ile çalıştırılabilir.
Şekil 4. ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN deney akışının şematik diyagramı
Bölüm 4. YEASEN Konkanavalin A-Kaplamalı Manyetik Boncuklar
YEASEN tarafından geliştirilen ConA manyetik boncuklar, sıkı hammadde seçimi ve çoklu proses optimizasyonu ve iyileştirmesinden sonra glikoproteinlere, glikolipidlere, polisakkaritlere ve glikosilasyon modifikasyonlu diğer moleküllere hızlı, etkili, hassas ve spesifik bir şekilde bağlanma yeteneğine sahiptir. Esas olarak hücre izolasyonu veya hücre veya doku lizatları veya serumdaki glikoproteinler gibi glikozlanmış moleküllerin izolasyonu için kullanılır ve özellikle CUT &RUN ve CUT&Tag (ChIP-seq deneyleri için yenilikçi bir teknoloji) gibi deneyler için doğrudan kullanılır.
1.Ürün Özellikleri
- Kararlı seri üretim ve sonuçların daha iyi tekrarlanabilirliği;
- Kararlı performans depolama
- Hücre yakalama verimliliği >%90
2.Ürün Bilgileri
| Kedi NO. | Kedi#19810ES |
| Boyut | 1mL/5mL/20mL |
| Renk | Kahverengimsi sarı |
| Boncuk konsantrasyonu | 10 mg/mL |
| Sağlam içerik | 9-11 mg/mL |
| Boncuk boyutu | 1 µm |
| Kapasite | 105 hücreler/µL boncuklar |
3.Ürün Performans Verileri
(1)Monodispersite
Aynı işlem koşulları altında ve 10×/40× büyütme altında, ConA boncukları temel olarak monodispersti ve rakiplere kıyasla belirgin bir aglomerasyon gözlenmedi.
| YEASEN Hammadde boncukları | Rakip ConA boncukları | YEASEN ConA boncukları（Kat#19810） |
Şekil 5. Monodispersite sonuçlarının grafiği
(2)ConA boncuklarının hücre bağlama etkisi
Aynı sayıda hücre, aynı süre boyunca boncuklarla inkübe edildi ve ConA boncuklarının konjugasyonundan sonra kalan hücre sayısı hücre analizörü altında otomatik olarak tespit edildi ve sonuçlar YEASEN'in ConA boncukları (Cat#19810) rakip ürünlerin performansını geride bıraktı.
| Hücre süspansiyonu | Rekabetçi ConA manyetik boncuklarının bağlanmasından sonra kalan hücreler | YEASEN bağlanmasından sonra kalan hücreler ConA manyetik boncuklar |
Şekil 6.ConA manyetik boncuk bağlı hücrelerinin resmi
(3)Hücre Bağlanma Sayısı ve Tekrarlanabilirlik
Hem 10µL YEASEN ConA Boncukları (Cat#19810) ve 10µL Rakip ConA Boncukları, rakiple karşılaştırılabilir E7 seviye hücre sayılarını bağlar. Hücre yakalama, tekrarlanan işlemlerde >%90'dı.
Şekil 7. Sonuçlar ConA boncuklarının bağlanma hücre sayısı ve yakalama oranı
(4)İvmelenme Stabilitesi
Tüp başına 1 mL olarak dağıtın. Saklama koşulları şöyleydi: 2, 4, 7, 11 ve 14 gün boyunca 4℃, 37℃ hızlandırılmış işlem ve 1, 3, 6 ve 8 gün boyunca -20℃ imha işlemi. Sonuçlar, aynı deneysel koşullar altında: 4℃'de, 37℃'de hızlandırılmış işlem ve -20℃'de imha işleminde depolanan ürünlerin hücre yakalama oranının >%95 olduğunu ve her işlem koşulu altında üç tekrar grubunun CV değerinin %1 içinde olduğunu ve bunun iyi tekrarlanabilirlik gösterdiğini gösterdi.
Şekil 8. Sonuçlar Farklı sıcaklık ve zaman altında ConA boncuklarının hücre yakalama oranı ve tekrarlanabilirlik önyargısı
Sipariş bilgileri
| 19810ES |