Yeni nesil dizileme kütüphanesinin olmazsa olmaz bir parçası olan NGS Adaptörü, test edilen DNA parçası ile Akış hücresini (Dizileme çipi) bağlamada rol oynar. Eklemin verimliliği, kütüphanenin kalitesini ve verimini belirlemede önemli bir faktördür. Peki NGS adaptörü nedir? Yaygın NGS adaptör tipleri nelerdir? Ve dizileme platformlarınız için doğru NGS adaptörleri nasıl seçilir?

1. NGS Adaptörü Nedir?

2. NGS endeksini seçerken hangi faktörleri göz önünde bulundurmalısınız?

3. Yaygın endeks türleri nelerdir?

4. Yaygın olarak kullanılan NGS adaptör tipleri nelerdir?

• UMI Adaptörü
• Tam adaptörler
• Eksik adaptörler
• Tn5 adaptörleri

5. Dizileme platformlarınız için doğru NGS adaptörleri nasıl seçilir?

6. Okuma ile ilgili

1. NGS Adaptörü Nedir?

Dizilemede bir dizi adaptör olan NGS Adapter, bilinen bir diziye sahip kısa bir nükleotid dizisidir. Hedef nükleik asit parçasının her iki ucuna bağlanır. Dizileme sırasında, kütüphaneyi çipe birleştirmek için Flow hücresindeki bilinen diziyle hibritleşerek dizilemeye başlar. Peki NGS adaptörünün yapısı nedir?

Örnek olarak Illumina platformunu ele alırsak, bir NGS adaptörü üç bölüme ayrılabilir:

P5 ve P7: Akış hücresinde P5 ve P7 uçlarıyla birleştirilen dizi, kütüphaneyi dizileme çipine sabitler ve Köprü-PCR yoluyla küme reaksiyonunu kolaylaştırır.

Rd1 SP ve Rd2 SP (Read1/Read2 dizileme primeri): Dizileme primerlerinin bağlanma bölgeleri, dizinin okunmaya başladığı pozisyonu gösterir.

Dizin (barkod olarak da bilinir): Karma kütüphanenin dizilenmesinde farklı örnekleri ayırt etmek için kullanılan bilinen sentetik dizi.

İncir. 1 Illumina platformu tek dizin kütüphanesi

İncir. 2 MGI platform tek uçlu dizin kütüphanesi

Dizileme verimindeki artışla, birden fazla örnek aynı anda dizilenebilmektedir. Bu nedenle, farklı örnekleri nasıl ayırt edeceğiniz özellikle önemlidir. Daha önce belirtildiği gibi, NGS adaptörünün dizin dizileri, yeni nesil dizilemede (NGS) çeşitli örnekleri ayırt etmek için kullanılır. Dizin seçerken hangi faktörleri göz önünde bulundurmalısınız? Lütfen okumaya devam edin...

2. Endeks seçerken hangi faktörleri göz önünde bulundurmalısınız?

İndeks genellikle 6nt-18nt uzunluğundadır ve indeks sayısına göre tek indeks ve çift indeks olmak üzere ikiye ayrılır. Çift indeks test edilecek parçanın her iki ucunda bulunur. Bir indeks kombinasyonu seçerken baz dengesi ve floresan dengesi dikkate alınmalıdır.

Temel bakiye, tek bir endeksteki temel bakiyeden ziyade, birden fazla endeks arasındaki dengeyi ifade eder. Hem temel türleri hem de temel dağılımı açısından dikkate alınması gerekir. Birleştirme ilkesi, aynı endeks grubunda yer alan A/T/C/G isimli dört bazın dahil edilmesi gerektiğidir ve bu dört bazın oranı birbirine yakın olup, sırasıyla yaklaşık %25'tir.

Floresan sinyal dengesi, baz dengesi garanti edilemediğinde floresan sinyallerinin dengesini sağlama seçimini ifade eder. Illumina platformundaki 4 kanallı sekansörde, dG/dT yeşil floresanla, dC/dA ise kırmızı floresanla etiketlenir. Dizileme sırasında başarılı bir dizilemenin sağlanması için her döngüde hem yeşil hem de kırmızı floresan sinyallerinin bulunması gerekir. Bu nedenle endeks seçilirken yeşil sinyal ile kırmızı sinyal arasındaki dengeye dikkat edilmelidir.

3. Yaygın endeks türleri nelerdir?

Yaygın ikili endeksler genellikle Benzersiz İkili Endeks (UDI), Benzersiz İkili Barkod (UDB) ve Birleşik İkili Endeks'i (CDI) içerir ve bunlar endeks atlamasını ve yanlış atamayı önemli ölçüde azaltır.

UDI&UDB: Her iki uçtaki endeksler birebir birbirine karşılık gelir, gruplar halinde tasarlanmıştır ve her iki uçta çapraz doğrulanabilir;

Yeasen (Cat#12404ES/12405ES) tarafından sağlanan Illumina için bir Stubby UDI Primer Kiti>>

CDI: Her iki uçtaki endeksler belirli gereksinimlere göre birleştirilerek çift uçlu bir endeks kütüphanesi oluşturulabilir;

Yeasen tarafından sağlanan Illumina için 384 CDI Primer, Set1-Set2 (Kat#)12412ES/12413ES)>>

Illumina, verimi ve amplifikasyon verimliliğini artırmak ve dizileme maliyetini azaltmak amacıyla Novaseq ve diğer yüksek verimli dizileyiciler için dizi akış hücresi (PFCT) ve özel amplifikasyon (ExAmp) kümeleme teknolojisini tanıttı ancak istemeden örnek etiket uyuşmazlığı olgusunu ve indeks atlamasını artırdı.

Şekil 3 Illumina'nın farklı cihaz modelleri desensiz akış hücresi veya desenlenmiş akış hücresi benimsiyor

HiSeq3000/4000, HiSeq X Series ve NovaSeq gibi dizileme platformlarının vurguladığı dizin çemberleme sorununu telafi etmek için Illumina, dizini kütüphanenin her iki ucuna koyma stratejisini önerdi; bu, ikili doğrulama gerçekleştirebilir ve uyumsuz adaptörleri ortadan kaldırabilir. Her iki uçta da benzersiz dizinler kullanıldığında, dizin hata tahsis oranı %0,01'e düşecektir. Önceki geleneksel dizin permütasyon grubu kombinasyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, dizin sıçraması iki büyüklük sırası kadar azaltılacaktır.

PCR içermeyen bir kütüphanenin inşasında, tek uçlu bir indeks adaptörü mevcuttur. Etiket uyumsuzluğu esas olarak dizileme hatalarından kaynaklanır. Genel olarak, etiket uyumsuzluk oranı düşüktür (%0,0004 ortalama, %0,001'e kadar). Ancak, hedefli bir yakalama kütüphanesinin inşasında, birden fazla adım etiket uyumsuzluğuna yol açacağı ve genellikle UDI/UDB/CDI adaptörleri kullanılacağı için çapraz konuşma sorunu artar.

4.NGS adaptörlerinin yaygın türleri nelerdir?

Dizileme teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, tek indeksli/çift indeksli adaptörler (3. bölümde belirtildiği gibi), UMI adaptörleri, transpozaz adaptörleri, tam/tamamlanmamış adaptörler vb. gibi çeşitli uygulama senaryolarına uygun daha fazla adaptör türü ortaya çıkıyor. Bu bölüm, adaptör seçiminin temelini oluşturmak için bu adaptörleri sistematik olarak sıralar.

4.1 UMI Adaptörü

Benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) adaptörü, düşük frekanslı mutasyon tespiti ve mutlak kantifikasyon için bir uç araçtır. UMI, bilinen bir diziye sahip rastgele bir sentetik dizidir. Tamamen rastgele bir nükleotid zinciri, kısmi dejenerasyonlu nükleotid zinciri veya sabit nükleotid zinciri olarak tasarlanabilir.Uzunluk genellikle 10nt (tek uçlu UMI) veya 5-8nt'dir (çift uçlu UMI). İşlevi, amplifikasyondan önce DNA parçalarının durumunu dondurmaktır ve her DNA molekülü bir UMI'ye karşılık gelir. Bu nedenle, biyoenformatiğin analizi sırasında, farklı kaynaklardan gelen DNA şablonlarını ayırt edebilir, PCR amplifikasyonu ve dizileme sürecindeki rastgele hatalardan kaynaklanan yanlış pozitif mutasyonları ve aslında hastalar tarafından taşınanları ayırt edebilir, böylece arka plan gürültüsünü filtreleyebilir, düşük frekanslı ve son derece düşük frekanslı mutasyonların doğru tespitini gerçekleştirebilir ve farklı DNA moleküllerinin mutlak kantifikasyonunu gerçekleştirebilir. Özellikle tümör araştırmaları alanında, düşük frekanslı mutasyon tespitinde yaygın olarak kullanılır.

Şekil 4 UMI adaptörünün şematik diyagramı Illumina platformunun yapısı

4.2 Tam adaptörler

PCR içermeyen bir kütüphane için gerekli bir ürün olan komple adaptörler, Illumina platformunda P5, P7, RdS1 ve RdS2 gibi dizilemeler için gereken tüm dizileri içerir, ayrıca dizileme gereksinimlerine göre dizileri ve UMI dizilerini indeksler. Komple adaptörlerle, PCR aracılığıyla başka adaptörler tanıtılmadan doğrudan dizilenebilir. Bu nedenle, komple adaptörler PCR içermeyen bir kütüphane oluşturmak için kullanılabilir. PCR içermeyen kütüphaneler, PCR amplifikasyon önyargısını, hata oranını ve dizi çoğaltmasını azaltabilir, popülasyon genom araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bazı yüksek GC veya yüksek AT bölgelerinin kapsamını artırabilir.

Yeasen (Cat#13519ES/13520ES) tarafından sağlanan Illumina platformu için eksiksiz bir adaptör ürünü>>

Yeasen (Cat#13360ES/13361ES) tarafından sağlanan MGI platformu için eksiksiz bir adaptör ürünü>>

Şekil 5 Tam adaptör diyagramı

4.3 Eksik adaptörler

Eksik adaptörlerin, adaptör ligasyonundan sonra PCR ile diğer dizileri tanıtarak tam bir adaptör oluşturmaları gerekir. Yüksek bağlantı verimliliği ve yüksek etkili kütüphane oranı ile karakterize edilirler. PCR işlemi, etkili kütüphanenin konsantrasyonunu sağlamak için tam kütüphane için bir zenginleştirme etkisidir ve ayrıca çift uçlu indeksler ve UMI dizileri de tanıtabilir.

4.4 Tn5 adaptörleri

Tn5 adaptörleri, adaptör dizisinin bir kısmını Tn5'in restriksiyon endonükleaz aktivitesi aracılığıyla DNA parçalarının her iki ucuna bağlar. Zamandan ve örneklerden tasarruf etmek için parçalanma ve adaptör ligasyonunun aynı anda gerçekleştirilmesini sağlarlar. Son olarak, bağlayıcı dizisinin geri kalanı, dizin, UMI ve diğer diziler PCR ile tanıtılarak eksiksiz bir kütüphane oluşturulur. Bir Cut&tag kütüphanesi oluşturmak için kullanılabilir.

Şekil 6 Tn5 adaptör kütüphanesi yapımının şematik diyagramı

5. Dizileme platformlarınız için doğru NGS adaptörleri nasıl seçilir?

Şu anda Illumina ve MGI olmak üzere iki ana akım dizileme platformu bulunmaktadır. NGS sağlayıcısı için eksiksiz bir çözüm olan Yeasen, Illumina veya MGI platformlarına uygun birden fazla NGS adaptörü geliştirmiştir.

Illumina platformu açısından, Yeasen tarafından sağlanan Illumina NGS adaptörleri UDI, CDI ve tek bir endeks olmak üzere üç tür içerir. MGI platformu açısından, Yeasen tarafından sunulan MGI NGS adaptörleri Dual içeren iki türe sahiptir UMI-UDB ve Tek Endeks.Aşağıdaki tabloda adaptör tipleri, mevcut ebatlar, adaptör ve primer konsantrasyonları da dahil olmak üzere ürün bilgilerini listeledik.

Komple ve UDI NGS adaptörleri, kolay kullanım isteyen müşteriler için uygun olup, bağlantı sorunları konusunda endişe etmenize gerek kalmaz; CDI NGS adaptörleri daha az tüpe ve küçük boyuta sahip olup, kolayca saklamak ve taşımak isteyen müşteriler için uygundur. PCR içermeyen komple NGS adaptörlerinin kullanılmasını gerektirir.

Illumina için

Tüp içinde	Yüksek NGS® DNA Lib Hazırlığı Illumina için 384 CDI Primer, Set 1 (8*12, 96 indeks)	12412ES
	Yüksek NGS® DNA Lib Hazırlığı Illumina için 384 CDI Primer, Set 2 (8*12, 96 indeks)	12413ES
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer Illumina için, Set 1 (96 indeks)	12414ES
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer Illumina için, Set 1 (96 indeks)	12415ES
Tabakta	Illumina (1-384 Endeksi) Seti 1-4 için Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kiti	12407ES
	Illumina için Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kiti Set1（96 kuyulu Plaka, 1-96 İndeks） 1. Set	12327ES
	Illumina için Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kiti Set2（96 kuyulu Plaka, 97-192 İndeks） 2. Set	12328ES
	Illumina için Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kiti Set3（96 kuyulu Plaka, 193-288 İndeks） 3. Set	12329ES
	Illumina için Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kiti Set4（96 kuyulu Plaka, 289-384 İndeks） 4. Set	12330ES

Okuma ile ilgili

NGS kütüphanesi yapımında yer alan temel enzimler

NGS ile ilgili teknoloji hakkında ne kadar bilginiz var?

NGS'deki çeşitli manyetik boncuk türleri: DNA\RNA\mRNA manyetik boncuklar

NGS kütüphane kantifikasyonu: Hızlı ve Doğru Qubit veya Hassas qPCR？Hepsi gerekli!