NGS'deki çeşitli manyetik boncuk türleri: DNA\RNA\mRNA manyetik boncuklar
Manyetik boncuklar, yüksek verimli dizileme kütüphanelerinin inşasında gerekli ürünlerden biridir. DNA veya RNA'yı saflaştırabilir, hedef boyutlu DNA parçalarını tarayabilir ve hedef nükleik asitleri zenginleştirebilirler. Dizileme teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, DNA saflaştırma manyetik boncukları, DNA boyut seçimi manyetik boncukları, RNA saflaştırma manyetik boncukları ve mRNA zenginleştirme manyetik boncukları dahil olmak üzere farklı uygulama alanlarında uzmanlaşmış manyetik boncuklar ortaya çıkmıştır. Peki çeşitli manyetik boncukların prensipleri nelerdir? Nasıl seçilir?
Toplu Alımlarda Ücretsiz Numune ve Daha Düşük Fiyat İsteyin
1. DNA boncukları
2. Yıldız DNA boncukları tanıtımı
3. RNA saflaştırma boncukları
4. mRNA ile zenginleştirilmiş manyetik boncuklar
5. Yeasen manyetik boncuk ürün önerisi
1. DNA Boncuklar
1.1 Temel ilkeler
Nükleik asidin manyetik boncuklarla saflaştırılması ilkesi katı fazda geri dönüşümlü immobilizasyona (SPRI) dayanır. Belirli koşullar altında, nükleik asit manyetik boncuklara seçici olarak bağlanırken, kirleticiler çözeltide kalır. Manyetik alan uygulandıktan sonra, hedef moleküllerle bağlanan manyetik boncuklar çözeltiden ayrılır ve daha sonra manyetik boncuklar kirleticileri daha da gidermek için temizlenir. Manyetik boncuklar ve nükleik asit moleküllerinin birleşimi geri dönüşümlü olduğundan, nükleik asit manyetik boncuklardan düşük tuz tamponuyla elüe edilebilir.
Manyetik boncukların dış yüzeyi silikon hidroksil veya karboksil fonksiyonel gruplarıyla modifiye edilmiştir. PEG ve yüksek tuz iyonları içeren saflaştırma tampon sisteminde, DNA, DNA tuz iyon karboksil grubunun bir iyon köprüsünü oluşturarak boncuklarla bağlanır. Bu bağlanma geri dönüşümlüdür. İyon köprüsü, PEG ve tuz iyonları olmayan TE tamponunda kaldırılır ve son olarak DNA saflaştırılır. Karboksil manyetik boncuklara dayanarak, farklı manyetik boncuk girişleri ve saflaştırma tamponları farklı parça boyutlarını bağlayacaktır. Manyetik boncuklar tercihen büyük DNA parçalarını bağlar, bu nedenle ilk turda, manyetik boncuklar hedef parçadan daha büyük parçaları bağlamak için kullanılır ve üst sıvı tutulur; İkinci turda, manyetik boncuklar üst sıvıdaki hedef parçayı bağlar ve ardından üst sıvıyı atar; Son olarak, hedef parça, DNA parçalarının hedef boyutta olduğu manyetik boncuklardan elüe edilir.
Şekil 1. Karboksil manyetik boncuk yapısı
Şekil 2. DNA saflaştırma manyetik boncuklarının prensibi
1.2 Operasyon Süreci
Şekil 3. DNA saflaştırma adımları
Şekil 4. DNA boyut seçimi adımları
1.3 Manyetik boncukların kullanımı için ipuçları
Geliştirilmiş verim ve doğru boyut seçimi
(1) Kullanmadan önce iyice karıştırın ve dengeleyin Manyetik boncukları en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
——PEG'nin manyetik boncuklardaki çözünürlüğü tampon pH ve sıcaklıktan kolayca etkilenir.Kullanmadan önce dengelenmesi gerekir oda sıcaklığına getirmek için Manyetik boncuklar eşit şekilde askıya alınır ve PEG tamamen çözülür, böylece adsorpsiyon ve ayırma etkilerinin etkilenmesi önlenir
(2) Adsorpsiyon süresi yeterli olmalı ve tamamen karıştırılmalıdır adsorpsiyonu yeterli kılmak için;
(3) Saflaştırma veya ayırma sırasında %80 etanol ile yıkama;
——%80 etanol altında, nükleik asit dehidrate edilir ve sıkıca toplanır ve çözünmez. Sistemdeki kalıntı enzimler, tamponlar, safsızlıklar vb. daha saf bir ürün elde etmek için etanol ile temizlenir kütüphane.
(4) Boyut seçimi sırasında, manyetik boncuk ekleme oranının doğru olduğundan emin olmak için numune hacmini onaylayın;
——Boyut seçimi sırasında manyetik boncukların karşılık gelen hacminin doğru girilmesi gerekir, böylece oran doğru olur, çünkü tampon içindeki PEG ve tuz iyon konsantrasyonundaki değişim sonuçları etkileyebilir.
(5) Elüasyon adımından önce alkolün tamamen uçmasına izin verin, ancak boncukların düşmesini önle aşırı kurutma
——Genellikle 2~3 dakikada kurutulabilir. Manyetik boncuk sayısı fazla ve kurutulması zor olduğunda, Çoklu santrifüj tüplerinde çalışılması tavsiye edilir.
(6) Manyetik boncuklar kümelenmiş veya levha haline getirilmişse, elüsyon süresi uzatılabilir tamamen karıştırıldıktan sonra;
——Buna şunlar neden olabilir: DNA'daki kirlilikler veya çok uzun kurutma süresi. Genellikle, DNA'da çok fazla safsızlık olduğunda, önce onu arındırmak önerilir önce boyut seçimi.
2. Yıldız DNA boncuk tanıtımı
Hieff NGS™ DNA seçim boncukları, ithal manyetik boncuk ham maddeleri ve NGS kütüphanesinin inşası sırasında DNA parçacığı boyutu seçimi ve saflaştırması için kullanılabilen optimize edilmiş bir tampon sistemi kullanılarak SPRI (katı faz ters immobilizasyon) prensibine dayanmaktadır. Kullanılan AMPure XP boncuklarıyla aynı şekilde kullanılır ve parçacığın geri kazanım verimliliği ve kütüphane boyutu dağılımı bunlarla oldukça uyumludur.
2.1 Arıtma performansının tanıtımı
- Benzersiz tampon sistemi: DNA parçaları aşağıya doğru 50bp kurtarılabilir.
- Yüksek iyileşme oranı: ≥%90.
- Kirlilikleri etkili bir şekilde giderin: Primer dimer, dNTP, inorganik tuz ve protein gibi kirleri etkili bir şekilde giderin.
- Geniş uygulama alanı: Enzim sindirimi, ligasyon, klonlama ve NGS kütüphanesi oluşturma gibi senaryolarda DNA saflaştırma için uygundur.
Tablo 1. Farklı oranlarda manyetik boncukların DNA saflaştırma ve geri kazanım verimliliği
| Deneyim Grubu | Bu partideki manyetik boncukların geri kazanım konsantrasyonu (ng/μL) | Kurtarma Oranı | AMPure XP boncuk Grubu (ng/μl) ④ | Kurtarma Oranı | ÖZGEÇMİŞ% | |||
| Oran | ① | ② | ③ | Ortalama | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | %96,92 | 22.2 | %94,37 | %2,55 |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | %82,19 | 17.8 | 75.67% | 6.52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42% | 16.2 | 68.87% | %2,55 |
Şekil 5. Manyetik boncuk agaroz jel elektroforezi sonuçlarının saflaştırma etkisi
M：1kb DNA merdiveni;
2.2 Boyut seçimi performansı
- Kolay ile Çalıştırma: Ayırma ilkesi ve deneysel çalışma XP manyetik boncuklarla tamamen uyumludur
- Doğru boyut seçimi: Sıralanmış parçaların boyutu doğru ve kararlıdır
- Geniş uygulanabilirlik: şunlar için uygundur: bina DNA ve RNA kütüphaneleri ve adaptasyon Çeşitli örnek tiplerinin parça boyut seçimi
- Ultra yüksek maliyet performansı: istikrarlı kalite, daha ekonomik fiyat, daha dikkatli satış öncesi ve satış sonrası hizmet
Şekil 6. DNA Boyut seçimi sonuçları
3. RNA Saflaştırma boncukları
Hieff NGS™ RNA temizleyici, proteinleri, tuz iyonlarını ve diğer safsızlıkları etkili bir şekilde gidererek yüksek saflıkta konsantre RNA örnekleri elde edebilen ve RNA yapısının stabilitesini korumak ve RNA bozulmasını önlemek için asidik tampon sistemini dikkatlice optimize edebilen SPRI prensibine dayanmaktadır. RNA kütüphanesi yapımı, rRNA gideriminden sonra toplam RNA örneklerinin saflaştırılması, in vitro transkripsiyona uğramış RNA ürünlerinin saflaştırılması, RNA etiketli ürünlerin saflaştırılması, sentetik RNA'nın saflaştırılması vb. için uygundur.
- Yüksek kalite: ithal hammaddeler, yüksek kalite istikrarı
- Optimize edilmiş tampon sistemi: RNA'nın saflığını ve bütünlüğünü garanti altına alın ve RNA bozunmasını etkili bir şekilde önleyin
- Yüksek verimlilik: verimli geri kazanım, RNA kütüphanesi yapımı veya in vitro için uygundur transkripsiyon ürünü geri kazanımı vb.
Şekil 7. Saflaştırmadan sonra farklı numunelerin elektroforetogramı
4. mRNA ile zenginleştirilmiş manyetik boncuklar
4.1 mRNA izolasyonunun ilkesi
mRNA ayırma ve zenginleştirme manyetik boncukları, oligo (dT) ile yüzey modifiye edilmiş manyetik boncuklardır. Hibridizasyon ilkesi sayesinde, mRNA'yı Poly A kuyruğu ile spesifik olarak bağlayabilir ve mRNA'yı toplam RNA veya doku hücrelerinden spesifik olarak ayırabilirler. Optimize edilmiş ürün formülüne sahip bu kit, hayvanların, bitkilerin, böceklerin ve ökaryotik mikroorganizmaların hücre ve dokularının RNA'sından yüksek saflıkta tam mRNA'yı verimli bir şekilde izole edebilir.
Şekil 8.mRNA manyetik boncuklarının zenginleştirilmesi ve saflaştırılması ilkesi
4.2 mRNA izolasyon boncuklarının performansı
Hieff NGS™ mRNA İzolasyon Ana Kiti, Yeasen tarafından toplam RNA'dan mRNA izolasyonu için bağımsız olarak geliştirilmiştir. mRNA yakalama boncukları, oligo (dT) ile modifiye edilmiş mikron boyutlu paramagnetik mikro kürelerdir. Poli (A) kuyruklu mRNA ile birleştirilerek, mRNA iyi bütünlüğe sahip 10 ng-4 μg toplam RNA'dan izole edilir ve saflaştırılır.
- Yüksek verimlilik: mRNA saflaştırması 45 dakika içinde tamamlanabilir
- Yüksek saflık: oligo (dT) manyetik boncuklar mRNA'ya özel olarak bağlanır
- Güvenilir: elde edilen mRNA, in vitro NGS için uygundur çeviri, RT-PCR ve cDNA sentezi
Şekil 9. Farklı RNA örneklerinden mRNA'nın mRNA izolasyon kiti saflaştırılması
Not: housekeeping gen verimi, mRNA iyileşmesinin etkisini temsil eder. rRNA ile ilişkili gen verimi karakterizasyon rRNA çıkarma verimliliği
4.3 mRNA manyetik boncuk SSS
(1) Manyetik boncuklar neden kümeleşir ve bu sorun nasıl çözülür?
——Manyetik boncuklar aglomerasyon, mRNA'nın verimini ve saflığını azaltacaktır. Örnek, polisakkaritler, proteinler ve uzun zincirli DNA gibi birçok safsızlık içerebilir. Bu safsızlıklar manyetik boncuklara yol açacaktır aglomerasyon. Çözüm, manyetik boncukları bir pipetten üflemektir. Genomik DNA, saflaştırma öncesinde DNase işlemi ile uzaklaştırılabilir. Başlangıç örnek boyutu çok büyükse ve manyetik boncukların yükünü aşarsa, manyetik boncuklar da kümeleşecektir. Kılavuzdaki giriş miktarına göre çalıştırılması önerilir.
(2) mRNA verimi neden düşüktür?
——Düşük mRNA veriminin birçok nedeni vardır:
- Hücre veya dokuların mRNA ekspresyon seviyesi düşük olduğundan, uygun ekspresyon periyodundaki örnekleri seçebilir veya örnek toplam RNA giriş miktarını uygun şekilde artırabiliriz.
- Manyetik boncukların numunelere oranı çok düşük, bu da mRNA ve manyetik boncukların kombinasyonunu etkiliyor. Artırmaya çalışın Manyetik boncuk sayısını azaltmak veya numune giriş miktarını ve hacmini azaltmak.
- Hibridizasyon süresi çok kısa olduğundan, inkübasyon süresi 10-15 dakikaya kadar çıkarılabilir;
- Elüsyon yeterli değilse, elüsyon tamponunun hacmini uygun şekilde artırmak, elüsyon süresini ve sıcaklığını artırmak veya elüsyon adımını iki kez tekrarlamak gerekir.
(3) rRNA'yı etkili bir şekilde nasıl ortadan kaldırabiliriz?
——Eğer işlem uygunsuz olursa, rRNA saflaştırma sırasında mRNA ile birlikte manyetik boncuklara spesifik olmayan bir şekilde bağlanacaktır, özellikle toplam RNA girdisi büyük miktarda olduğunda. Arıtma sürecinde genellikle iki tur bağlama kullanılır rRNA kirliliğini etkili bir şekilde önlemek için. Yıkama deneyi sırasında nonspesifik bağlanmayı gidermek ve rRNA kirliliğini gidermeye çalışmak için tam olarak karıştırıldığından emin olun.
(4) Birçok alt akış uygulaması için mRNA'nın elüsyonu gerekli midir ve manyetik boncuklar alt akış enzim reaksiyonlarına müdahale eder mi?
——RNA kütüphanesi oluşturma sürecinde mRNA parçalanması ve ters transkripsiyon gibi bazı alt akış reaksiyonları, mRNA elüsyonuna gerek kalmadan doğrudan manyetik boncuklarla gerçekleştirilebilir.Ancak PCR reaksiyonları gerçekleştirilecekse, genomik DNA kirliliğinin olmadığından emin olmak gerekir, aksi takdirde deneysel sonuçları etkileyecek çok sayıda genomik amplifikasyon parçası üretilecektir. RNA-Seq kütüphanesi yapımı gibi ilgili alt akış reaksiyonlarının talimatlarına göre ayrıntılı işlemler gerçekleştirilebilir
(5) Kit, mRNA'yı doğrudan hücrelerden veya dokulardan ayırabilir mi?
——Tavsiye etmiyorum! Lizat, mRNA'nın bağlanmasını etkileyecek bazı bileşenler içerir. Özel bir kit kullanılması önerilir.
5. Yeasen manyetik boncuk ürün önerisi
Hieff NGS™ serisi manyetik boncuklar, Yeasen yıldız ürünleri olarak çeşitli uygulamaları karşılamak için mükemmel performansa ve yüksek üretim kapasitesine sahiptir ve Beckman AMPure XP boncuklarının yerini sorunsuz bir şekilde alır. 2018'deki lansmanından bu yana Yeasen manyetik boncuklar sektörde iyi bir üne kavuştu ve satışlar artmaya devam etti. İyi kalite ve düşük fiyat açısından en iyi seçimdir.
Tablo 2. Yeasen manyetik boncuk ürün önerisi
| Ürün adı | Kedi# | Şartname | Kullanım ve uygulama senaryoları |
| Yüksek NGS™ DNA Seçim Boncukları | 12601ES03 | 1 ml | 👉NGS DNA arıtma ve boyut seçimi 👉PCR ürün saflaştırması 👉Enzim sindirimi ve ligasyon ürünlerinin saflaştırılması |
| 12601ES08 | 5 ml | ||
| 12601ES56 | 60 ml | ||
| 12601ES75 | 450 ml | ||
| Yüksek NGS™ RNA Temizleyici | 12602ES03 | 1 ml | 👉RNA saflaştırma 👉rRNA uzaklaştırıldıktan sonra toplam RNA örneklerinin saflaştırılması 👉RNA etiketli ürünlerin saflaştırılması |
| 12602ES08 | 5 ml | ||
| 12602ES56 | 60 ml | ||
| 12602ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ mRNA İzolasyon Ana Kiti | 12603ES24 | 24 dakika | 👉mRNA izolasyonu ve saflaştırılması 👉In vitro transkripsiyon mRNA saflaştırması |
| 12603ES96 | 96T |
Okuma ile ilgili
NGS ile ilgili teknoloji hakkında ne kadar bilginiz var?
DNA seçim boncuklarının geçmişini ve bugününü anlamak için 5 dakika (sonuç analizi ve SSS yorumlaması dahil)