Moleküler biyolojideki en temel deneylerden biri olan nükleik asit kantifikasyonu, doğrudan alt akış deneylerinin sonucunu etkiler. Nükleik asit kantifikasyonunun doğruluğu çok önemlidir. Şu anda, NGS kütüphane kantifikasyonunun iki ana yöntemi vardır: ultraviyole emilim yöntemi ve floresan boya yöntemi.

Ultraviyole emilim yöntemi, DNA ve RNA'nın kantifikasyonu için 260 nm'deki emilimi ölçmek için bir spektrofotometre kullanır. Ayrıca OD260/OD280 oranını hesaplayarak nükleik asitlerin saflığını tahmin eder. Ancak, tespit edilen değerler serbest nükleotidler, tuzlar ve organik bileşikler gibi diğer kirleticilerden kaynaklanan girişimlere karşı oldukça hassastır.

Qubit florometrik kantitasyon, çift sarmallı DNA, tek sarmallı DNA, RNA veya proteinlere özel olarak bağlanan floresan boyaları kullanır. Belirli bir dalga boyu ışık kaynağı tarafından uyarıldığında, boyalar, numunede bulunabilecek diğer safsızlık moleküllerinden etkilenmeyen floresan yayar. Floresan yoğunluğu, numunedeki hedef moleküllerin konsantrasyonuyla orantılıdır.

Tablo 1. Ana Akım Nükleik Asit Kantifikasyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Hedef	UV Abs(Nanodrop)	Kübit DNA HS	Kübit DNA BR	Kübit RNA	Kübit ssDNA
Nükleik asit türü	DNA、RNA	dsDNA	dsDNA	RNA	ssDNA, oligo
Numune Konsantrasyonu (ng/μL)	2 ng/μL-15 μg/μL	10 pg/µL-100 ng/µL	0,1 ng/µL-1000 ng/µL	250 pg/µl-1000 ng/µl	50 pg/μL-200 ng/μL
Avantaj	Kantifikasyonun üst sınırı	İyi özgüllük	Geniş nicelik aralığı	RNA için oldukça seçici	İyi tolere edildi
Sınırlamalar	Zayıf özgüllük	Kullanım sırasında ışıktan koruyunuz	Kullanım sırasında ışıktan koruyunuz	Kullanım sırasında ışıktan koruyunuz	Zayıf özgüllük ve ayrıca dsDNA'ya bağlanır

UV absorbansı ve Qubit florometrik kantifikasyonun her birinin kendine göre avantajları vardır ve birbirlerini tamamlayabilirler. Konsantrasyon, saflık ve kirleticilerin varlığını belirlemek için rutin nükleik asit örneklerinin ön kantifikasyonu için absorbans kantifikasyon yöntemi seçilebilir. Kübit kantifikasyonu, düşük konsantrasyonlu değerli numuneler veya yeni nesil dizileme ve gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi sonraki deneyler için gereken hassas kantifikasyonlar için daha uygundur.

Yeasen Qubit için dsDNA HS Analiz Kiti: Qubit için birkaç Qubit kantifikasyon ürünü piyasaya sürdü^® (Cat#12640), Kullanıma hazır: Qubit için 1× dsDNA HS Analiz Kiti^® (Cat#12642), Qubit için ssDNA Analiz Kiti^® (Cat#12645) ve piyasaya sürüldükleri günden bu yana büyük beğeni toplayan dsDNA BR Assay Kit (Cat#12643).

Çözüm 1 dsDNA HS Yüksek Hassasiyetli Kantifikasyon

Kullanıma hazır dsDNA kantifikasyon ön karışımı—Qubit için 1× dsDNA HS Analiz Kiti^®

^{Kolay kullanım: Kullanıma hazır ön karışım, ön karıştırmaya gerek yoktur;}

^{Yüksek hassasiyet: Tespit edilebilir konsantrasyon 50 pg/μL kadar düşüktür;}

^{İyi stabilite: Floresan sinyali 3 saat sürer ve oda sıcaklığında 20 gün boyunca saklanması kantifikasyonun doğruluğunu etkilemez;}

^{A.Mükemmel stabilite: Oda sıcaklığında 2 hafta saklandığında bile stabilitesini korur (ölçülen değer teorik değerden %10'dan daha az sapar).}

Tablo 2. Rakiplerle Karşılaştırıldığında 4°C ve Oda Sıcaklığında Farklı Numunelerin Kararlılık Testi

Kantitatif reaktifler	Azimli konsantrasyon λDNA'nın (ng/μL)
	0 gün		1 gün		3 boyutlu	7d			10d		14 gün
T* 4℃	0,51		0,496		0,524	0,534			0,495		0,499
Yeasen 4℃	0,51		0,508		0,513	0,475			0,48		0,495
Yeasen oda sıcaklığı depolamak	0,51		0,517		0,506	0,486			0,506		0,523
Kantitatif reaktifler	Azimli konsantrasyon buzağı gDNA'sının (ng/μL)
	0 gün	1 gün		3 boyutlu			7d	10d		14 gün
T* 4℃	55.3	53.5		55.40			57.9	55.8		58
Yeasen 4℃	59.4	55.4		57.8			56.1	56.3		59,8
Yeasen oda sıcaklığı depolamak	59	55.7		61.3			58	58.7		56.1

B. Yüksek hassasiyet, partiden partiye iyi kararlılık

Tablo 3.Farklı Partilerin Stabilite Testi

Bek	Örnek	L*			Yeasen			hata
		konsantrasyon1（ng/μL）	konsantrasyon2（ng/μL）	Ortalama（ng/μL）	konsantrasyon1（ng/μL）	konsantrasyon2（ng/μL）	Ortalama（ng/μL）
D9801060	λDNA	0,3160	0,3250	0,3205	0,320	0,320	0,320	0,16%
D8801050		0,3310	0,3320	0,3315	0,319	0,306	0,3125	5.73%
D7813110		0,345	0,358	0,352	0,334	0,329	0,332	-6.03%

Çözüm 2 dsDNA BR Geniş Aralıklı Kantifikasyon

Geniş aralıklı dsDNA kantifikasyonu—dsDNA BR Analiz Kiti

Yüksek hassasiyet: Tespit edilebilir konsantrasyon 50 pg/μL kadar düşüktür;

Mükemmel doğrusallık: 2-1000 ng aralığında iyi doğrusallık;

Kirleticilere karşı güçlü tolerans: Yaygın kirleticilere karşı tolerans gösterebilir.

Tablo 4. Rakiplere Göre Kirleticilere Karşı Dayanıklılık ve Tolerans

Yeasen BR						T* BR
standart	RFU1	RFU2	Ortalama	hata		standart	RFU1	RFU2	Ortalama	hata
S1	159.63	160,71	160.17	%1		S1	216.17	211.56	213.865	-2%
S2	24497.0	25078.64	24787,82	%2		S2	20532.46	20452.26	20492.36	0%
ölçülendirme						ölçülendirme
Kirletici	10-μL numunedeki konsantrasyon	konsantrasyon1	konsantrasyon2	Ortalama	Test edilecek/kontrol edilecek	Kirletici	10-μL numunedeki konsantrasyon	konsantrasyon1	konsantrasyon2	Ortalama	Test edilecek/kontrol edilecek
Kontrol (H)2O)	/	49	48.6	48,8	0,0%	Kontrol (H)2O)	/	49,8	48	48.9	0,0%
BSA	1mg/mL	51.8	52	51.9	6.4%	BSA	1mg/mL	54	51.2	52.6	7.6%
Etanol	%20	44.6	44	44.3	-9.2%	Etanol	%20	44.8	43.4	44.1	-9.8%
kloroform	4.00%	49.0	49,8	49.4	%1,2	kloroform	4.00%	50.0	47	48.5	-0,8%
SDS	%0,2	46.6	45,8	46.2	-5.3%	SDS	%0,2	53.2	51.6	52.4	7.2%
Trition-X100	0,20%	41.6	40.6	41.1	-15.8%	Trition-X100	0.%20	53	51	52.0	%6,3
dNTP'ler	2mM	44.2	45	44.6	-%8,6	dNTP'ler	2mM	47,8	46.4	47.1	-%3,7

Çözüm 3 ssDNA Kantifikasyonu

ssDNA kantifikasyonu için ideal seçim—Qubit için yüksek maliyet-performanslı ssDNA Analiz Kiti^®

^{Yüksek hassasiyet: Saptanabilir konsantrasyon 50 pg/μL kadar düşüktür;
Mükemmel doğrusallık: 0-200 ng aralığında iyi doğrusallık;
Kararlı sinyal: Geliştirilmiş optimize edilmiş tamponla birleştirilmiş mükemmel boya, oda sıcaklığında kararlı floresan yoğunluğunu koruyabilir ve tuzlar, serbest nükleotidler, çözücüler, deterjanlar veya proteinler gibi yaygın kirlilik ortamlarında bile yüksek oranda uygulanabilir olup doğru kantifikasyonu garanti eder;
İyi stabilite: 4°C veya 25°C'de 6 aylık tedaviden sonra performansta önemli bir değişiklik görülmedi;
Geniş uygulama aralığı: Basit çalışma süreci, oligonükleotidlerin, primerlerin, denatüre DNA'nın, tek zincirli dairesel DNA'nın vb. hızlı bir şekilde kantifikasyonunu sağlar.}

A.İyi tekrarlanabilirlik: Farklı Qubit cihazlarında, farklı tipteki numunelerde niceleme Yeasen Cat#12645'in birden fazla partisi test edildi. 0-200ng aralığında, farklı Qubit enstrümanlarından yapılan ölçümlerde iyi tekrarlanabilirlik.