Organoid ekimi için kapsamlı rehber

— Organoidler hakkındaki anlayışınızı derinleştirecek kapsamlı bir makale.

Organoidlere Giriş

Organoidler, vücudun dışında 3 boyutlu kültürleme yoluyla elde edilen, iç organların veya dokuların normal (veya hastalıklı) durumunu taklit eden fizyolojik işlevlere sahip üç boyutlu yapılardır. Daha basit terimlerle, organoidler, kök hücrelerin bir matris jelinde kültürlendiği üç boyutlu hücre kültürleridir. Kimyasal inhibitörlerin/aktivatörlerin, sitokinlerin ve kültür katkı maddelerinin etkisi altında, organoidler karşılık gelen organlara benzer doku yapılarına dönüşür.

Organoidlerin Özellikleri

Organoidler, kaynak dokunun fizyolojik yapısını ve işlevini koruyarak kendini yenileme yeteneklerine sahiptir. Genellikle "bir kaptaki mikro organlar" olarak adlandırılırlar. Kök hücrelerin kendini yenileme, farklılaşma ve kendini organize etme yeteneklerini kullanan organoidler, biyobankalarda kullanılmak üzere kriyoprezervasyona tabi tutulabilir ve sınırsız genişlemeye uğrayabilir. Organoidler oldukça karmaşıktır ve 2D hücrelerle karşılaştırıldığında, in vivo durumuna daha çok benzer.

Şekil 1. İnsan kolon adenokarsinom hücrelerinin organoid kültürü [1]

Organoidlerin Uygulamaları

Organoidlerin ayırt edici özelliği, in vivo ortamı daha iyi simüle edebilme yetenekleridir ve bu da onları moleküler ve hücresel biyoloji analizleri için uygun hale getirir. Hayvan ve hücre seviyeleri arasındaki boşluğu kapatan organoidler, tümör çalışmaları, ilaç taraması, rejeneratif tıp ve daha fazlası gibi alanlarda araştırma için üstün bir çözüm sunar. Fonksiyonel doku indüksiyonu, hastalık modeli oluşturma, ilaç taraması, anti-inflamatuar testler, klinik araştırma ve çeşitli diğer araştırma yönlerinde yaygın olarak uygulanmış olup, hem temel araştırma hem de translasyonel uygulamalarda büyük potansiyel göstermektedir.

Organoid yetiştirme sistemleri ve deneysel teknikler gelişmeye devam ettikçe, organoidler bağırsaklar (ince bağırsak/kolon), mide, karaciğer, kalp, akciğerler, prostat, pankreas, böbrekler, memeler, beyin benzeri yapılar, retina, iç kulak ve daha fazlası dahil olmak üzere çeşitli dokular ve organlar için kullanılmıştır.

Tümör kök hücrelerinden türetilen organoidler, tümör oluşumu ve gelişimi mekanizmalarını anlama, ilaç duyarlılığını tarama ve hassas tıp ve kişiselleştirilmiş tanıyı teşvik etme konusunda önemli bir potansiyel göstermiştir. Cell and Science'dan birden fazla makale, organoidlerin antikanser ilaçlarının etkinliğini tahmin etmede yüksek duyarlılık ve özgüllük sergilediğini göstermektedir. Son zamanlarda, tümör organoidleri, hastaların kanser ilaçlarına verdiği tepkileri tahmin etme ve kişiselleştirilmiş tedavi planlarının oluşturulmasına yardımcı olma rollerini göstermiştir.

Gelişim Mekanizmalarını Araştırmak: Organoidlerin farklılaşma yetenekleri onları embriyonik gelişim süreçlerini ve mekanizmalarını incelemek için uygun hale getirir. Wnt ve BMP gibi sinyal yolları tarafından düzenlenen indüksiyon süreçleri beyin, pankreas ve mide gibi organların gelişimini incelemek için kullanılabilir [2][3][4].

Hastalık Yaralanma Modellerinin Oluşturulması: Belirli dokulardan veya organlardan kaynaklanan organoidler, belirli hastalıkların modellerini incelemek için kullanılabilir. Zhao Bing ve Lin Xinhua liderliğindeki ekipler, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun ve karaciğer hasarının moleküler mekanizmalarını incelemek için insan organoid enfeksiyon modellerini kullanarak virüsün patojenik mekanizmalarını ve ardından ilaç geliştirmeyi araştırmak için önemli araçlar sağladı [5]. Pekin Üniversitesi Yaşam Bilimleri Okulu'nda Deng Hongkui liderliğindeki araştırma grubu, hasar rejenerasyonu özelliklerine sahip yeni bir bağırsak organoidinin yapımını teşvik etmek için küçük moleküller ve sitokinler kullandı - Hiper Organoid.Bu organoid, uzun bir süre boyunca geçirilebilir ve çoğaltılabilir, böylece genom korunur ve kolon dokusu hasarının onarımı desteklenir, akut kolit hayvan modelinde patolojik semptomlar hafifletilir ve daha fazlası sağlanır [6].

Rejeneratif Tıp: Kök hücreden türetilen organoidler, normal doku işlevini geri kazandırmak için hasarlı veya hastalıklı dokuları onarabilir veya değiştirebilir. Diğer nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, retina bozuklukları, omurilik yaralanmaları ve daha fazlası dahil olmak üzere hücre terapisinde kapsamlı uygulamalara sahiptirler. Rejeneratif tıp alanında yeni bir tedavi olarak - SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 ve Sonic Hedgehog (Shh) proteini gibi küçük moleküller kullanan DA01, çok yönlü kök hücrelerin dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını uyarır. Bu nöronlar daha sonra geç evre Parkinson hastalığı hastalarının beyinlerinin yaralı bölgelerine nakledilir ve hastalığın tedavisi için yeni bir yön ve yaklaşım sağlar [7].

İlaç Toksisitesi ve Etkinlik Testi: Organoidler, yeni ilaçların belirli organlarda veya dokularda farmakotoksisitesini doğrulamak için kullanılabilir ve yeni ilaç geliştirme için veri desteği sağlar. Hyman böbrek organoidlerinin Cisplatin'in böbrek toksisitesini doğrulamak için kullanılması bir örnektir [8].

İlaç Taraması: Kök hücrelerden türetilen organoidler, ilaç reaksiyonlarının in vitro test edilmesinde kullanılabilir ve ilaç taraması için teorik destek sağlar. Kolon organoidleri, CFTR mutasyonları olan hastalar için ilaç planlarını incelemek için kullanılabilir ve tümör organoidleri, hastalar için kişiselleştirilmiş ilaç durumlarını değerlendirmek için kullanılabilir [9].

Organoidlerin Gelişimsel Tarihi

Organoidlerin Kaynakları

Normal organoidler, pluripotent kök hücreler (PSC'ler) ve yetişkin kök hücreler (ASC'ler) dahil olmak üzere öncelikle kök hücrelerden kaynaklanır. Pluripotent kök hücreler, embriyonik kök hücreleri (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içerir. Pluripotent kök hücrelerle karşılaştırıldığında, yetişkin kök hücrelerin modellenmesinin daha basit ve daha hızlı olması avantajı vardır, ancak nispeten daha basit olan organoid yapıları inşa etme dezavantajı vardır. Pluripotent kök hücrelerden inşa edilen organoid yapılar daha karmaşıktır.

Kullanılan ürünler Organoidlerin Yetiştirilmesi

Organoid Kültüründe Yaygın Olarak Kullanılan Küçük Moleküller (Özet): Çok pratik, yer imlerine eklemeyi unutmayın!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): ATP rekabetiyle p160ROCK (Ki=140 nM) ve ROCK-II'yi (IC50=800 nM) rekabetçi bir şekilde inhibe eden güçlü bir Rock inhibitörüdür.Ayrıca PRK2'yi (IC50=600 nM) inhibe eder. Tipik olarak plaka kültüründe ilk ekim sırasında eklenir; sonraki ortam değişiklikleri ekleme gerektirmeyebilir. İnsan embriyonik kök hücrelerinin 1 saat boyunca Y-27632 (10 µM) ile muamelesi apoptozu inhibe edebilir, klon verimliliğini artırabilir ve hücre geçişlerini uzatabilir.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 10 μM

❷ SB-202190 (Kat#53005ES): p38α/β'yi hedef alan etkili bir p38 MAPK kinaz inhibitörüdür. SB202190, insan embriyonik kök hücrelerinin kalp kası hücrelerine farklılaşmasını sağlayabilir, nöral kök hücrelerinin kendini yenilemesini destekleyebilir ve gastrointestinal ve meme bezi organoidlerinin kültürüne uygulanabilir.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 10 mg'ı 3,018 mL DMSO'da çözerek 10 mM'lik bir çözelti elde edin; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): GSK-3 (GSK3α/β) inhibitörü olarak etki eden bir aminopirimidin türevidir. İnsan embriyonik kök hücrelerinin endoderme farklılaşmasını sağlar ve böbrek ve retina organoid kültürlerinde kullanılır. CHIR-99021, diğer reaktiflerle birlikte kullanıldığında somatik hücre yeniden programlamasını kök hücrelere uyarır.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 3 mM'lik bir çözelti elde etmek için 5 mg'ı 3,58 mL DMSO'da çözün; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): ALK5/4/7 kinaz aktivitesini inhibe eden bir Aktivin/NODAL/TGF-β yolağı inhibitörü. Genellikle karaciğer, prostat ve meme bezi organoidlerinin kültüründe kullanılır. Genellikle indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) farklılaşmasını inhibe etmek ve hücrelerin in vitro kendi kendini yenilemesini sürdürmek için kullanılır.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 2 mM'lik bir çözelti elde etmek için 5 mg'ı 5,93 mL DMSO'da çözün; -20℃'de saklayın. (Not: Bu ürün çözelti içinde kararsızdır ve hazırlandıktan hemen sonra kullanılması önerilir.)

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 2 μM

❺ Gastrin I (Cat#53007ES): Gastrin, gastrik duvar hücrelerini gastrik asit salgılamaya teşvik eden endojen bir gastrointestinal peptit hormonudur. Gastrointestinal organoidler üzerindeki çalışmalar için çok önemlidir. Bağırsak ve hepatik organoidleri kültüre alırken, gastrin eklemek organoidlerin hayatta kalma süresini uzatmaya yardımcı olur.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 0,2 mM çözelti elde etmek için 2,38 mL %1 amonyak çözeltisinde 1 mg çözün; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 10 nM

❻ Nikotinamid (Cat#51402ES): Bir B3 vitamini olan nikotinamid, çeşitli enzimatik redoks reaksiyonlarına katılır ve gastrointestinal, hepatik ve meme bezi organoidlerinin kültüründe kullanılır. Nikotinamid, sitokinler ve diğer biyokimyasal reaktiflerle birlikte anti-inflamatuar özellikler gösterir, mezenkimal kök hücrelerinin insülin üreten hücrelere farklılaşmasını destekler, sirtuin aktivitesini inhibe eder ve organoid oluşumunu desteklemek ve organoid ömrünü uzatmak için kullanılır.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 100 mg'ı 8,19 mL H2O'da (veya DMSO'da) eriterek 100 mM'lik bir çözelti elde edin; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 10 mM

❼ Forskolin (Cat#51001ES): Forskolin, hücre içi cAMP seviyelerini yükseltmek için yaygın olarak kullanılan adenilat siklazı aktive edebilir. Forskolin, çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını başlatır, PXR ve FXR'yi aktive eder ve antiplatelet agregasyonu ve antihipertansif etkilere sahiptir. Hepatik organoidleri kültüre ederken, bu maddeyi eklemek esastır.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 1-10 μM

❽ Prostaglandin E2 (Kat#60810ES): Prostaglandin E2 (PGE2) hücre çoğalması ve farklılaşmasını sağlayarak birçok fizyolojik sistemi düzenler.Karaciğer ve prostat organoidlerinin kültürlenmesinde gereklidir ve düz kas gevşemesi, inflamasyon, üreme, uyku döngüsü düzenlenmesi ve mide mukoza bütünlüğü ile ilişkilidir.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 1 mg'ı 0,28 mL DMSO'da eriterek 10 mM'lik bir çözelti elde edin; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 500 nM

❾ N-asetil-L-Sistein (Kat#50303ES): N-asetil-L-sistein (NAC), antioksidan glutatyonun öncüsüdür ve antioksidan ve ROS inhibitör etkilerine sahiptir. Nöronal hücre apoptozunu inhibe eder ve çoğu organoidin kültür sürecinde gereklidir.

Önerilen çözünme konsantrasyonu: 500 mM çözelti elde etmek için 2 g'ı 24,51 mL H2O'da (veya DMSO'da) çözün; -20℃'de saklayın.

Önerilen çalışma konsantrasyonu: 1 mM

İlgili ürün bilgisi

Referanslar：

[1] Sato T, Stange DE ve diğerleri.İnsan kolonundan epitel organoidlerin uzun süreli genişlemesi, adenom, adenokarsinom ve Barrett epitelyumu. Gastroenteroloji. 2011 Kasım;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Eylül 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, ve diğerleri. Beyin organoidleri insan beyni gelişimini ve mikrosefaliyi modelliyor. Doğa. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, ve diğerleri. Yapay üç boyutlu nişler, in vitro pankreas gelişimini bozar. Geliştirme. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, ve diğerleri. Pluripotent kök hücreden türetilen mide organoidlerinde insan gelişimi ve hastalıklarının modellenmesi. Doğa. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, ve diğerleri. İnsan karaciğer kanal organoidleri ile SARS-CoV-2 enfeksiyonu ve kolanjiyosit hasarının özetlenmesi. Protein Hücresi. 2020 Ekim;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, ve diğerleri. Yaralanmayla ilişkili epitel rejenerasyonunu modelleyen bağırsak organoid kültürlerinin oluşturulması. Cell Res. 2021 Mar;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 Jan 8. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics, İleri Parkinson Hastalığı Olan Hastalarda 1. Faz Çalışmasında İlk Hastaya DA01 Dozunun Verildiğini Duyurdu. BlueRock Therapeutics Basın Bülteni: 8 Haziran 2021.

[8] Takasato M, Er PX, ve diğerleri. İnsan iPS hücrelerinden elde edilen böbrek organoidleri, birden fazla soy hattı içerir ve insan nefrogenezini modellemektedir. Doğa. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN ve diğerleri. İnsan pluripotent kök hücrelerinin in vitro bağırsak dokusuna yönlendirilmiş farklılaşması. Doğa. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.