HEK293 Ana Hücre Kalıntı DNA Parçası Analiz Kiti aşağıdakiler için tasarlanmıştır: Çeşitli uzunluklardaki HEK293 kalıntı DNA parçalarının ara ürünlerde, yarı mamul ürünlerde ve biyolojik preparatların son ürünlerinde kantitatif analizi. Bu kit, 10 fg/μL kadar düşük bir kantifikasyon sınırıyla hem 200 baz çiftinin altında hem de üstünde HEK293 DNA kalıntılarını spesifik ve hızlı bir şekilde tespit etmek için qPCR floresan prob prensibini kullanır. Ayrıca HEK293 DNA Kontrolünü (DNA kantitatif referansı) içerir. Bu kit, şirketin manyetik boncuk tabanlı kalıntı DNA örnek hazırlama kitleriyle birlikte kullanılabilir (Kedi#18461ES/18462ES).

Ürün bilgisi

Bileşen

Depolama ve nakliye:

1. Tüm bileşenler kuru buzda gönderilir ve teslim alındıktan sonra -25°C ila -15°C'de saklanmalıdır. Raf ömrü 2 yıldır. Bileşenler A ve B1, B2, B3 ve B4 ışıktan korunarak saklanmalıdır.

2. Teslim aldığınızda, 7 bileşenin tamamının mevcut olduğundan emin olun ve derhal önerilen sıcaklıklarda saklayın.

Önlemler:

1. Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır.

2. Güvenlik ve sağlık nedenleriyle, lütfen çalışma sırasında laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık eldiven giyin.

3. Bu reaktifi kullanmadan önce, kullanım kılavuzunu dikkatlice okuyun. Deneyler, örnek işleme, reaksiyon karışımlarının hazırlanması ve pipetleme dahil olmak üzere standart prosedürler izlenerek yapılmalıdır.

4. Her bileşen hafifçe çalkalanarak iyice karıştırılmalı ve kullanılmadan önce kısa bir süre santrifüj edilmelidir.

Uyumlu Enstrümanlar:

Aşağıdakilerle sınırlı olmamak üzere, aşağıdaki araçlar: Termo Bilimsel: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: CFX96 Optik Modülü, Shanghai Hongshi Tıp Teknolojisi: SLAN-96S

Kullanım Talimatları

1. HEK293 DNA Kontrol Kantitatif Referansının Seyreltilmesi ve Standart Eğrilerin Hazırlanması

HEK293 Parça Analiz Kiti, farklı uzunluklarda dört amplifikasyon parçacığı içerir: 82 bp, 133 bp, 227 bp ve 515 bp. Standart eğriler oluştururken, her amplifikasyon parçası için ayrı eğriler oluşturun ve karşılık gelen standart eğrilere dayanarak bunların kalıntı miktarlarını ve bağıl dağılımlarını hesaplayın.

Kitte sağlanan DNA Seyreltme Tamponunu kullanarak HEK293 DNA Kontrol Kantitatif Referansının gradyan seyreltmesini gerçekleştirin. Seyreltme konsantrasyonları şu şekilde olmalıdır: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL ve 30 fg/μL.

Ayrıntılar şu şekildedir:

1)Kitten HEK293 DNA Kontrol ve DNA Seyreltme Tamponunu buz üzerine koyup çözün. Tamamen çözüldükten sonra, karıştırmak için hafifçe vorteksleyin ve tüpün dibinde çözeltiyi toplamak için kısa bir süre (10 saniye) santrifüj edin.

2)Altı adet temiz 1,5 mL santrifüj tüpü hazırlayın ve bunları Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 ve Std5 olarak etiketleyin.

3). Std0 etiketli tüpe 90 μL DNA Seyreltme Tamponu ve 10 μL HEK293 DNA Kontrolü ekleyerek 3 ng/μL konsantrasyona ulaşın. Karıştırmak için hafifçe vorteksleyin ve kısa bir süre (10 saniye) santrifüj edin. Bu konsantrasyon, kısa süreli kullanım için (3 aya kadar) -20°C'de bölünüp saklanabilir. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının.

4). Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 ve Std5 etiketli tüplere önce her birine 90 μL DNA Seyreltme Tamponu ekleyin. Her seyreltme adımı hafifçe karıştırılmalı ve homojenliği sağlamak için kısa bir süre santrifüj edilmelidir. Daha sonra gradyan gerçekleştirin seyreltmeler aşağıdaki gibidir:

Tablo 1: Standart Gradyan Seyreltme

* Her konsantrasyon için 3 tekrar gerçekleştirin. Bu reaktif 300 pg/μL ila 30 fg/μL doğrusal aralığında test yapabilir. Gerekirse doğrusal aralık uygun şekilde genişletilebilir veya daraltılabilir.

** Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerini azaltmak ve kontaminasyonu önlemek için, DNA kantifikasyonunun alikotlanması ve saklanması önerilir Sİlk kullanımda -20°C'de ısıtılmalıdır.

*** Kullanılmayan, çözülmüş DNA seyreltmesi 2-8°C'de 7 güne kadar saklanabilir. Uzun süre kullanılmayacaksa -20°C'de saklayın.

**** Şablonun tamamen karışmasını sağlamak için her gradyan seyreltimini yaklaşık 1 dakika boyunca yavaşça çalkalayın.

2. Test Numunesinin Hazırlanması (TS)

Deney düzeneğine göre test numunesi TS'yi aşağıdaki şekilde hazırlayın:

1) 100 μL test örneğini alın ve 1,5 mL'lik temiz bir santrifüj tüpüne ekleyin. TS olarak etiketleyin, örnek ön işlemini gerçekleştirin ve t hazırlayın.O saflaştırmave test örneği.

2) Dört farklı uzatma uzunluğunu aynı anda analiz etme gereksinimini karşılamak için, önceden işlenmiş test numunesinin miktarı ≥120 μL olmalıdır. Bu nedenle, her numuneden 2 tüpün ön işlem için hazırlanması ve ekstraksiyondan sonra kullanım için karıştırılması önerilir.

3. Negatif Ekstraksiyon Kontrolünün (NCS) Hazırlanması

Deney düzeneğine göre negatif ekstraksiyon kontrolü NCS'yi aşağıdaki şekilde hazırlayın:

1) Örnek matris solüsyonundan (veya DNA seyreltmesinden) 100 μL alın tampon) ve 1,5 mL temiz bir santrifüj tüpüne ekleyin. NCS olarak etiketleyin.

2) Test örnekleri partisiyle birlikte negatif kontrol NCS'nin numune ön işlemini gerçekleştirin ve saflaştırılmış negatif kontrol NCS çözeltisini hazırlayın.

3) Dört farklı uzatma uzunluğunun aynı anda analiz edilmesi gereksinimini karşılamak için, önceden işlenmiş NCS numunesinin miktarı ≥120 μL olmalıdır. Bu nedenle, her NCS numunesinden ön işlem için 2 tüp hazırlanması ve ekstraksiyondan sonra kullanım için karıştırılması önerilir.

4. Şablonsuz Kontrol (NTC) Hazırlanması

Şablonsuz kontrol NTC'yi deney düzeneğine göre aşağıdaki şekilde hazırlayın:

1) Şablonsuz Kontrol (NTC) numune gerektirmez ön işlem, ve qPCR kullanılarak kalıntı DNA içeriğinin saptanması aşamasından itibaren hazırlanabilmektedir.

2) Her tüp veya kuyu için, NTC örneği 20 μL karışımdan (yani, 15 μL HEK293 qPCR Karışımı + 5 μL karşılık gelen HEK293 Primer ve Prob Karışımı) + ​​10 μL DNA Seyreltme Tamponundan oluşur. 3 tekrar kuyusu için yeterli miktarda hazırlanması önerilir.

5. qPCR reaksiyon sistemi

Masa 2. Tepki sistemi için 82 bp parça

Masa 3. Tepki sistemi 133 için bp parçası

Masa 4. Tepki sistemi 2 için27 bp parçası

Masa 5. Tepki sistemi 515 için bp parçası

* Bu reaksiyon için gereken toplam Karışım miktarını kuyu sayısına göre hesaplamak için:

Karışım = (Tepkime kuyularının sayısı + 2) × (15 + 5) μL (2 kuyunun kaybını hesaba katmak için). Tipik olarak, her numune için 3 tekrar kuyusu hazırlanır.

** Reaksiyon kuyularının sayısı = (5 konsantrasyon gradyan standart eğrisi kuyusu + 1 Şablonsuz Kontrol (NTC) + 1 Negatif Kontrol Çözeltisi (NCS) + N Test Örneği (TS)) × 3.

NTC (Şablon Kontrolü Yok): DNA Seyreltme Tamponu

NCS (Negatif Kontrol Çözeltisi): Numune ön hazırlığından sonra numune matris çözeltisi veya DNA Seyreltme Tamponu-tedavi saflaştırılmış çözelti olan NCS'yi elde etmek için.

TS (Test Örneği): Test edilecek örnek.

***Numuneleri dağıttıktan ve tüpleri kapattıktan sonra, sıvıyı tüp duvarlarından dibe toplamak için düşük hızda (10 sn) kısa bir süre santrifüj edin. Sonra iyice karıştırmak için en az 5 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, başka bir düşük hızda santrifüjleme yapın (10 sn). Herhangi bir kabarcık varsa, bunları çıkardığınızdan emin olun.

Tablo 6: Referans Plaka Düzeni

Bu örnek göstermekHEK293 DNA'sının kalan amplifikasyon parçalarının analizi için qPCR tespit prosedürü.Test örnekleri şunları içerir: HEK293 DNA standart eğrisinin 5 konsantrasyon gradyanı, 1 test örneği (TS), 1 negatif kontrol solüsyonu (NCS) ve 1 şablonsuz kontrol (NTC). Her örnek için 3 tekrar kuyusu çalıştırılması önerilir.

6. Amplifikasyon Programı Parametreleri (Tburada-adım Yöntemi) (ABI 7500 qPCR Instrument, Yazılım Sürüm 2.0 kullanılarak örnek)**

1) Yeni bir boş program oluşturun ve tespit şablonu olarak "Mutlak Miktar Belirleme"yi seçin.

2) Dört farklı amplifikasyon parçacığı uzunluğu için, "HEK293-" adını vererek yeni tespit probları oluşturun.82", "HEK293-133", "HEK293-227"ve "HEK293-515". Muhabir floroforunu "FAM" ve söndürücü floroforu "hiçbiri" olarak seçin. Tespit için referans boyayı "ROX" olarak ayarlayın (referans boya, cihaz modeline ve diğer faktörlere bağlı olarak eklenebilir veya eklenmeyebilir).

3) "Seçili kuyulara hedef(ler) ata" panelinde, standart eğri kuyuları için "Görev" alanını "Standart" olarak ayarlayın ve "Miktar" alanındaki karşılık gelen değerleri "300000", "30000", "3000", "300", "30" (kuyu başına DNA konsantrasyonunu fg/μL olarak temsil eder). "Örnek Adı" alanındaki kuyulara "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL" adını verin. NTC kuyuları için "Görev"i "NTC" olarak ayarlayın. NCS ve TS kuyuları için "Görev"i "Bilinmeyen" olarak ayarlayın ve "Örnek Adı" alanında kuyulara "NCS" ve "TS" adını verin. Bu parametreleri ayarladıktan sonra, cihaz çalışmasını başlatmak için "Çalışmayı Başlat"a tıklayın.

4) Amplifikasyon programı ayarları: 30 μL reaksiyon hacmi ile üç adımlı amplifikasyon programını ayarlayın.

Masa7. PCR prosedürü

7. qPCR Sonuç Analizi

1) "Amplifikasyon Grafiği" altındaki "Analiz" panelinde sistem otomatik olarak "Eşik" değerini ayarlayacaktır. Bazen, varsayılan "Eşik" başlangıç ​​çizgisine çok yakındır ve bu da tekrarlar arasında önemli Ct varyasyonuna neden olur. "Eşik" değerini uygun bir konuma manuel olarak ayarlayabilir ve "Analiz"e tıklayabilirsiniz. Bu noktada, normal olup olmadıklarını görmek için "Çok Bileşenli Grafik"teki amplifikasyon eğrilerini önceden kontrol edebilirsiniz.

2) "Standart Eğri" altındaki "Analiz" panelinde, standart eğrinin R²'sini, amplifikasyon verimliliğini (Eff%), eğimini ve kesişimini okuyabilirsiniz. Normal bir standart eğri için: R² > 0,99, amplifikasyon verimliliği (%90 ≤ Eff% ≤ %110) ve -3,6 ile -3,1 arasında eğim.

3) "Kuyu tablosunu görüntüle" altındaki "Analiz" panelinde, şablonsuz kontrol (NTC), negatif kontrol (NCS) ve test örnekleri (TS) için "Miktar" sütununu fg/μL birimiyle okuyabilirsiniz. Birimler daha sonra raporda dönüştürülebilir.

4) Sonuç analizi için parametre ayarları, belirli cihaz modeline ve yazılım sürümüne bağlı olmalıdır. Genellikle, cihaz sonuçları otomatik olarak yorumlayabilir.

5) Negatif kontrolün (NCS) Ct değeri, standart eğrinin en düşük konsantrasyonunun ortalama Ct değerinden büyük olmalıdır.

6) Şablonsuz kontrolün (NTC) sonucu "Belirsiz" olmalı veya Ct değeri ≥ 32 olmalıdır.

Belge

Manuel