1.层粘连蛋白 521 的背景
层粘连蛋白 521 (LN521) 是天然干细胞微环境内的关键细胞粘附蛋白，也是人类胚胎干细胞 (hES) 和诱导性多能干细胞 (hiPSC) 培养和扩增的基质。LN521 与细胞表面受体结合并激活细胞信号通路，从而产生更多功能性细胞。
Laminin 521在体外重现了hPSC生物学相关的环境，促进hPSC的贴壁、高存活率和强的长期自我更新能力，是支持干细胞生长、维持基底膜结构和性能稳定的关键基质蛋白。Laminin 521也是最常用的无营养培养基质之一。此外，Laminin 521无需添加任何凋亡抑制剂，即可实现遗传稳定的多能干细胞的高效单细胞传代，细胞以均匀的单层生长，无需手动去除任何分化区域。此外，研究表明，LN521可支持PSC生长10代以上而无任何核型异常的迹象，并保持PSC分化为内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的能力。
图 1. 层粘连蛋白 521 结构 [1]
2.层粘连蛋白包被实验
2.1 用无菌去离子水或注射用水将层粘连蛋白521配制成400µg/ml，使用前建议用无菌1×DPBS（Ca++/Mg++）稀释至100µg/ml，再用无菌DPBS（Ca++/Mg++）稀释至工作浓度5-10µg/ml。包被浓度根据培养细胞种类不同有所差异，建议优化实验方案，确定最适合细胞的包被浓度，推荐浓度见表1。
笔记： 含 Ca 的 DPBS2+ 和镁2+ 应使用二价阳离子，因为二价阳离子对蛋白质结构和功能很重要。层粘连蛋白 521 所需的工作浓度取决于细胞和应用。我们建议初始涂层浓度为 0.5μg/cm2。
表 1. 不同培养容器的重组人层粘蛋白工作溶液的推荐体积。
| 培养皿 | 包被浓度（μg/mL） | LN521添加量 | 1*DPBS添加量 | 总体积 |
| 6 好 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 毫升/孔 |
| 12 好 | 5 | 25 μL/孔 | 475 μL/孔 | 0.5 毫升/孔 |
| 24 好 | 5 | 15 μL/孔 | 285 μL/孔 | 0.3 毫升/孔 |
| 四十八 好 | 5 | 7.5 μL/孔 | 142.5 μL/孔 | 150 μL/孔 |
| 96 井 | 5 | 3.5 μL/孔 | 66.5 μL/孔 | 70 μL/孔 |
| 35mm 培养皿 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 毫升/孔 |
| 60mm 培养皿 | 5 | 100 μL/孔 | 1900 μL/孔 | 2 毫升/孔 |
| 100mm 培养皿 | 5 | 300 μL/孔 | 5700 μL/孔 | 6 毫升/孔 |
以上体积基于包被浓度5μg/mL。
2.2 将规定体积的层粘连蛋白-DPBS 混合物加入每个孔中并轻轻摇晃。确保整个表面都覆盖有层粘连蛋白涂层溶液，因为未涂层的表面不支持细胞生长。
2.3. 将板放入 37°C 培养箱中孵育过夜。最短孵育时间为 2 小时，但建议孵育过夜以获得理想的细胞培养条件。注意不要让培养容器变干，这会导致 LN521 失活。
2.4. 当细胞准备好接种时，吸出层粘连蛋白 521 溶液。
3.iPSC培养
3.1 iPSC解冻（以12孔板为例）
3.1.1 从液氮或干冰中取出 iPSC，并在 37°C 水中解冻 10 秒。
3.1.2 用75％酒精对冷冻管进行消毒，并将其转移到工作台面上。
3.1.3 将细胞转移到一个新的含有9 mL DMEM-F12 的15 mL 离心管中。
3.1.4 将15 mL离心管于室温下以300g离心5分钟。
3.1.5 从包被的12孔板中丢弃层粘连蛋白溶液。
3.1.6 弃去细胞上清，将 iPSC 轻轻悬浮于 1 mL mTeSR-plus（含 10 µM Y-27632）中，转移至包被的 12 孔板中，摇动板子使细胞分布均匀，最终细胞密度为 1×10^5 个/孔，室温放置 10 分钟，确保培养在 4-5 天内传代。
3.1.7 将12孔板放回37℃培养箱中孵育。
3.1.8 含ROCK抑制剂的培养基应于12～16小时后弃去，在不含抑制剂的培养基中继续培养。
表2. 不同培养容器中细胞接种密度，根据细胞生长速度确定细胞数量
| 细胞培养容器 | 6 好 | 12 好 | 24 好 | 96 井 |
| 细胞数量 | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
3.2. iPSC 传代方案
3.2.1 弃去培养上清，用 1 mL PBS（Ca‑‑/毫克‑‑）。
笔记： 使用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，因为二价阳离子会对某些解离酶产生负面影响。
3.2.2 弃去 PBS，加入 0.5 mL 温和细胞解离试剂。在室温下孵育 6-8 分钟或在显微镜下观察，直到细胞不再结合在板上。
3.2.3 加入等体积的DMEM-F12，轻轻混匀细胞，转移至室温离心管中，300g离心5分钟。
3.2.4 在传代细胞之前，准备一个层粘连蛋白包被的12孔板。
3.2.5 弃去上清液，将细胞悬浮在含有 10 µM Y-27632。
3.2.6 将细胞转移至已准备好的层粘连蛋白包被的12孔板中，轻轻摇动板子使细胞分布均匀，室温放置10至20分钟。
3.2.7 将12孔板放入37℃培养箱中孵育。
笔记： iPSC 长成单层后会迅速分化并死亡。为了保持生长和多能性，它们需要在汇合前进行传代。
3.3. iPSC 的冷冻保存
3.3.1 配制温和细胞解离试剂。
3.3.2 按照iPSC传代方案进行细胞分离，通过细胞器计数确保冻存前细胞密度。
3.3.3 每管细胞应以1-2×10^6的细胞密度冷冻。按照iPSC传代方案中的离心和去除细胞培养基的步骤进行。将分离的iPSC沉淀重悬于适当体积的冷冻保存溶液中
3.3.4 将1 mL重悬后的细胞冻存沉淀加入到1.5 mL冻存管中，程序降温，然后转入液氮中长期保存。
4. 层粘连蛋白涂层的重要注意事项
4.1. 实验方案中的所有步骤均须在无菌条件下进行。
4.2. 避免将层粘蛋白长时间暴露于室温下。
4.3. 避免反复冻融
4.4. 解冻后未稀释的蛋白原液可在2~8℃无菌条件下保存，可稳定保存至少3个月。
5.相关产品信息
| 产品名称 | 猫＃ | 尺寸 |
| 92602ES | 10微克/100微克/500微克/1毫克 |
6.参考文献
[1]Pulido D、Briggs DC、Hua J、Hohenester E。层粘连蛋白β2短臂的晶体学分析揭示了LF结构域如何插入到规则排列的LE结构域中。Matrix Biol。2017年1月；57-58：204-212。