精准点突变检测的 PCR 方法 - ARMS

随着医学研究的不断进步，靶向治疗也日趋成熟。靶向治疗的前提是对药物的分子靶点进行基因检测，找出导致遗传性疾病或恶性肿瘤的基因突变。ARMS-PCR是一种基于PCR的新型方法，可以检测出大量的DNA点突变。它是目前癌症定制基因识别最重要和最广泛的方法之一。其治疗应用的益处已得到领域专家的充分认可。

1. 等位基因特异性 PCR 如何起作用？
2. 如何提高ARMS的特异性？
3. 提供的产品有哪些特点？ Yeasen？
4. 产品性能数据有哪些？
5. 人们如何订购产品？

1. 等位基因特异性 PCR 如何起作用？

ARMS-PCR即扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR），又称等位基因特异性PCR（AS-PCR），通过调控等位基因特异性延伸来识别野生型等位基因和突变野生型基因，利用Taqman探针技术测量荧光信号值。
ARMS PCR引物设计为等位基因上游两个引物的3’端核苷酸不同，两个引物分别针对野生型和突变型。在扩增过程中，与模板不完全匹配的上游引物无法形成互补碱基对，导致错配，延伸受阻，无法产生PCR产物，而与模板匹配的引物系统则可以扩增出相应的PCR产物。Taqman探针上的荧光团可以发出可被仪器检测到的荧光信号，通过评估荧光数据可以验证基因型。
ARMS技术灵敏度高，检测限可达100拷贝/mL，对肿瘤组织的检测限可达0.5%的突变率。另外，ARMS耗时短、成本低，结果直观易判断。这是因为ARMS结合qPCR或电泳技术，仅需进行一次PCR反应，耗时更少，ARMS技术仅需优化上游引物，相比采用MGB探针的实时PCR技术，成本更低，结果直观。由于石蜡包埋组织标本中提取的DNA大部分为片段化，无法得到准确的检测结果，ARMS方法设计时尽量缩短目标产物的长度，解决了石蜡包埋组织中的这一难题。同时，ARMS结合PCR平台实现闭管操作，操作简单，无需产物后处理，最大程度避免了扩增产物的污染。
理论上，Taq DNA聚合酶必须与引物3’端剩余的模板完全互补才能进行高效的聚合。但Taq DNA的严格性受多种因素影响，有些情况下即使引物的3’端碱基不与模板互补，延伸也能进行。如果3’端只有一个碱基错配，引物可以错配延伸，但延伸效率较低。不同的3’端错配，延伸效率也不同，如果在3’端引入其他错配的碱基，错配数量过多，3’端延伸到一定程度后就无法继续进行。因此，引物 3' 端仅有一个碱基错配无法充分区分两个等位基因，从而导致假阳性结果。

2. 如何提高ARMS的特异性？

提高ARMS特异性的重点是提高引物延伸特异性。错配碱基可以引入自3’端起第2个或第3个碱基，错配碱基与3’端错配碱基共同作用，在3’端不互补的模板中，引物扩增产物率降低。虽然引物在与其3’端互补的模板中可以正常扩增，但引物的错配碱基类型取决于3’端碱基错配的类型。
设计好针对ARMS的特异性引物后，需要一对用于等位基因特异性荧光共振能量转移的TaqMan探针。TaqMan探针有两种荧光染料，5’端为荧光基因，3’端为一般的荧光猝灭基因。在完整的探针中，猝灭剂基因和荧光基因在空间上靠得很近，导致荧光猝灭。正常情况下，5’端荧光团发出的荧光无法检测到，只能检测到3’端猝灭剂的背景荧光。在目标基因扩增过程中，PCR引物和荧光标记的探针在去OR时都会与目标序列互补。当Taq酶在延伸模板链时遇到与模板稳定结合的探针时，Taq酶的5’-3’外切酶会将与模板结合的特异性探针降解。探针上的荧光团被物理空间隔开，猝灭效应消失，发出荧光。弱荧光探针与靶序列的错配会减少释放的荧光量。